貓主要器官在貓瘟發(fā)病進(jìn)程中的進(jìn)行性變化

謝 穎，徐冬怡，胡先麗，王 革，魏學(xué)良

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚 400715；2.重慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校，重慶 九龍坡 401329)

貓瘟是由貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus，F(xiàn)PV)引起的一種急性、高度接觸性、高度致死性傳染病，各種年齡貓均可感染，臨床表現(xiàn)以患貓突發(fā)高熱、嘔吐、腹瀉、脫水及循環(huán)血流中白細(xì)胞減少為特點(diǎn)[1]，感染率可達(dá)70%，病死率為50%～60%[2]。Harrison T M等[3]的研究表明，自然條件下，貓細(xì)小病毒還可感染狐貍、豹、獅子、虎[4]和浣熊等珍惜野生動(dòng)物，給野生動(dòng)物保護(hù)造成巨大威脅。目前對(duì)貓細(xì)小病毒病原本身及疾病診斷與治療的研究較為完善，而缺乏對(duì)貓細(xì)小病毒感染過程器官動(dòng)態(tài)變化的相應(yīng)研究。本試驗(yàn)以動(dòng)物醫(yī)院搜集的臨床貓瘟病貓為病理模型，通過觀察貓瘟各時(shí)期貓細(xì)小病毒對(duì)組織臟器的損傷，推斷病毒侵染順序及組織器官受損的順序，為貓瘟致病機(jī)理的研究及其防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病例來源 在重慶各大動(dòng)物醫(yī)院選取臨床檢查貓細(xì)小病毒陽(yáng)性、冠狀病毒為陰性的病貓為試驗(yàn)材料，依據(jù)其臨床癥狀劃分為早期、中期、晚期3組。分組依據(jù)見表1。另外選取同窩的60日齡非免疫、貓細(xì)小病毒和貓冠狀病毒篩查陰性的臨床健康幼貓6只，其中3只攻毒制備潛伏期病例，3只作對(duì)照。

表1 貓瘟病貓分組依據(jù)

1.1.2 主要試劑 貓細(xì)小病毒(FPV)抗原檢測(cè)試劑盒、貓冠狀病毒(FCoV)抗原檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自韓國(guó)安捷公司；透射電鏡使用的戊二醛磷酸緩沖液，來自重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院電鏡實(shí)驗(yàn)室；蘇木素(蘇木色精)、曙紅Y(水溶)，均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；免疫組化染色使用的枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)、10×PBST緩沖液，均購(gòu)自上海永葉生物科技有限公司；DAB試劑盒，購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；貓細(xì)小單克隆抗體，購(gòu)自北京泰德瑞達(dá)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 潛伏期病例的復(fù)制 將已確診為單純性貓細(xì)小病毒感染的病貓安樂死后，取心、肝、脾、肺、腎等，用無菌剪刀剪碎后轉(zhuǎn)入無菌研缽，1∶5加入PBS緩沖液研磨成勻漿，移入無菌離心管差速離心，取上清液并加入青霉素、鏈霉素，-4 ℃保存，經(jīng)培養(yǎng)確定無菌后用于潛伏期病例的接種。接種方式為：每只幼貓腹腔注射1 mL，口服0.5 mL。接種后監(jiān)測(cè)幼貓?bào)w溫、食欲、精神狀態(tài)等，首次觀察到幼貓?bào)w溫升高時(shí)對(duì)其進(jìn)行貓細(xì)小病毒的檢測(cè)。

1.2.2 貓瘟各時(shí)期主要器官的病理組織學(xué)檢查 將潛伏期、早期、中期、晚期共12只病貓安樂死后進(jìn)行尸體剖檢，依次取腸、肝、脾、腎、肺、心、腦，迅速放入10%福爾馬林中固定，按照蘇木素的使用說明書進(jìn)行H.E.染色，用Leica TOMY SX-500生物顯微鏡進(jìn)行病理組織結(jié)構(gòu)觀察并采集圖像。

1.2.3 早期病貓主要器官的超微結(jié)構(gòu)檢查 將貓瘟早期病貓麻醉后進(jìn)行活體剖檢，無菌條件下取出其心、肝、脾、肺、腎、腦、腸，并在器官離體1 min內(nèi)從離體器官分離出8塊約1 cm3的組織塊，迅速投入戊二醛磷酸緩沖液，4 ℃保存并送至重慶醫(yī)科大學(xué)檢查。

1.2.4 晚期病貓主要臟器的免疫組織化學(xué)法觀察 貓瘟晚期病貓主要臟器石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原熱修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶活性消除、清洗、脫脂、顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、封片等過程處理后，進(jìn)行病理組織結(jié)構(gòu)觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 貓瘟各時(shí)期主要器官的病理組織學(xué)損傷

2.1.1 潛伏期的病理組織學(xué)損傷 腸、脾、肝、腎、心、腦、肺均未見異常。

2.1.2 早期的病理組織學(xué)損傷 腸：腸黏膜上皮細(xì)胞脫落和小腸絨毛縮短。脾：脾小梁結(jié)構(gòu)變得疏松且有紅細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象；脾小結(jié)數(shù)量增多，生發(fā)中心不明顯；紅髓內(nèi)出現(xiàn)少量的巨噬細(xì)胞。肝：肝組織中發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞淤積、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉間膽管和小葉間靜脈擴(kuò)張，紅細(xì)胞淤積。腎、心、腦、肺：均未見異常。

2.1.3 中期的病理組織學(xué)損傷 腸：腸黏膜出血、壞死、脫落，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見中插彩版圖1A)。脾：被膜增厚，脾小梁排列紊亂；脾小結(jié)減少；白髓中出現(xiàn)紅細(xì)胞浸潤(rùn)(見中插彩版圖1C)；動(dòng)脈管壁增厚，細(xì)胞腫脹，管腔狹窄的現(xiàn)象，有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)。肝：組織中出現(xiàn)紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；肝小葉的基本結(jié)構(gòu)被破壞，中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫并發(fā)生脫落，肝索與肝血竇排列紊亂，固有結(jié)構(gòu)消失；小葉間膽管和小葉間靜脈有紅細(xì)胞淤積。腎：腎小球毛細(xì)血管壁增厚。心：心肌細(xì)胞發(fā)生腫脹，心肌纖維出現(xiàn)變性、壞死、斷裂，部分溶解消失(見中插彩版圖1F)；組織間隙中發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。肺：肺泡壁增厚，肺泡周圍毛細(xì)血管擴(kuò)張；肺動(dòng)脈(見中插彩版圖1G)、肺靜脈內(nèi)均有紅細(xì)胞淤積。腦：靜脈內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞淤積。

2.1.4 晚期的病理組織學(xué)損傷 腸：腸黏膜表面出現(xiàn)由纖維蛋白和中性粒細(xì)胞等構(gòu)成的炎性滲出物，黏膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重壞死、脫落，腸黏膜下層與肌層發(fā)生分離(見中插彩版圖1B)，固有層出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。脾：組織內(nèi)出現(xiàn)滲血和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；固有層部分脾小梁變厚，結(jié)締組織增生，部分脾小梁發(fā)生變性、斷裂；白髓結(jié)構(gòu)消失，中央動(dòng)脈管壁增厚，管腔變小甚至閉鎖；紅髓中有大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(見中插彩版圖1D)。肝：肝小葉的基本結(jié)構(gòu)被破壞，中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫、脫落，肝索與肝血竇排列紊亂；小葉間膽管和小葉間靜脈出現(xiàn)紅細(xì)胞淤積(見中插彩版圖1E)。腎：腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小管管壁變厚，管腔狹窄。心：心肌結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維間隙變寬，出現(xiàn)斷裂、壞死、變性現(xiàn)象，組織間隙有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張且有紅細(xì)胞淤積。肺：肺泡壁增厚，肺泡周圍毛細(xì)血管擴(kuò)張；肺動(dòng)脈、肺靜脈內(nèi)均有紅細(xì)胞淤積。腦：實(shí)質(zhì)血管擴(kuò)張充血，紅細(xì)胞淤積，血管周圍間隙增寬且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生核固縮(見中插彩版圖1H)。

2.2 貓瘟早期主要器官超微結(jié)構(gòu)的變化 腸：眼觀可見腸黏膜表面有少量出血點(diǎn)，腸系膜血管充血。電鏡下發(fā)現(xiàn)受損白細(xì)胞(見圖2A)，且可見線粒體水腫和空泡化(見圖2B)。脾：脾輕微腫大，邊緣鈍圓，質(zhì)地變軟。電鏡下發(fā)現(xiàn)脾竇中出現(xiàn)受損白細(xì)胞(見圖2C)，線粒體出現(xiàn)水腫與空泡化，線粒體內(nèi)外膜間的間隙變寬且出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)(見圖2D)。肝：肝臟體積稍微增大，被膜緊張，質(zhì)地脆軟。細(xì)胞間隙增大，組織內(nèi)可見受損白細(xì)胞(見圖2E)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(見圖2F)，線粒體出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)。腦、肺、心、腎：眼觀及電鏡下均未見明顯病變。

圖2 感染早期貓相關(guān)組織的超微結(jié)構(gòu)變化(標(biāo)尺=1 μm)

2.3 貓瘟晚期病貓主要器官的免疫組織化學(xué)觀察 腸：視野下未見陽(yáng)性細(xì)胞(見中插彩版圖3A)。脾：強(qiáng)陽(yáng)性(見中插彩版圖3B)；陽(yáng)性細(xì)胞呈片狀大量出現(xiàn)，廣泛分布于整個(gè)脾臟。肝：陽(yáng)性(見中插彩版圖3C)；肝小葉中可見陽(yáng)性的枯否細(xì)胞。腎：弱陽(yáng)性(見中插彩版圖3D)；腎小管間隙中有極少量細(xì)胞呈陽(yáng)性，腎小球和腎小管未見陽(yáng)性細(xì)胞。心：陰性(見中插彩版圖3E)；心肌結(jié)構(gòu)正常，未見陽(yáng)性細(xì)胞。肺：弱陽(yáng)性(見中插彩版圖3F)；支氣管腔上皮、細(xì)支氣管上皮、肺泡隔中部分細(xì)胞呈陽(yáng)性。腦：弱陽(yáng)性(見中插彩版圖3G)；部分神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞呈陽(yáng)性。

3 討論

3.1 貓瘟各時(shí)期主要器官的病理組織學(xué)損傷

3.1.1 潛伏期 潛伏期未見明顯變化，推測(cè)可能是貓細(xì)小病毒正處于增殖階段，未來得及對(duì)機(jī)體組織器官造成損害，以致未觀察到明顯病變。

3.1.2 早期 病理組織學(xué)結(jié)果顯示，腸道、脾臟在早期損傷較為嚴(yán)重，肝臟病變輕微，其他器官未見明顯病變，說明這一時(shí)期貓細(xì)小病毒主要侵襲腸道和脾臟，然后再進(jìn)一步地侵襲機(jī)體其他器官。早期病貓的機(jī)體正處于積極的免疫應(yīng)答階段，此階段會(huì)產(chǎn)生白細(xì)胞和免疫球蛋白等物質(zhì)抵御貓細(xì)小病毒的侵襲。

3.1.3 中期 病理組織學(xué)結(jié)果顯示，貓瘟中期病貓的主要組織和器官已廣泛受到侵害并發(fā)生病變，在這個(gè)時(shí)期由于機(jī)體免疫系統(tǒng)受到了破壞，貓細(xì)小病毒得以繼續(xù)對(duì)機(jī)體其他主要器官進(jìn)一步侵襲。但是中期病貓的腦、心、肺的眼觀病理變化并不明顯，故可推測(cè)貓瘟中期細(xì)小病毒首先侵害脾、肝，后侵襲腎、心、肺、腦。

3.1.4 晚期 病理組織學(xué)觀察結(jié)果與邢建民[7]的觀察結(jié)果相似，這一時(shí)期機(jī)體各個(gè)內(nèi)臟器官均有明顯的病理變化，這些進(jìn)一步反映了貓細(xì)小病毒的泛嗜性和貓細(xì)小病毒對(duì)機(jī)體各主要器官的進(jìn)一步破壞。晚期貓瘟病貓機(jī)體出現(xiàn)多器官、多系統(tǒng)的病變及衰竭而使得該病的治療難度更大，治愈率更低。從腸道上出現(xiàn)的不可逆的損傷來看，晚期病貓的治療價(jià)值并不高。

3.2 貓瘟早期貓細(xì)小病毒對(duì)臟器及組織的損傷 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，貓細(xì)小病毒對(duì)器官及組織的損傷多表現(xiàn)在線粒體的結(jié)構(gòu)損傷上，受損細(xì)胞線粒體多出現(xiàn)腫脹、空泡化、髓樣結(jié)構(gòu)等變化。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的半自主細(xì)胞器，參與細(xì)胞氧化供能及細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。在細(xì)胞受到損傷時(shí)，線粒體首先受到影響而改變正常結(jié)構(gòu)，而線粒體的損傷造成細(xì)胞內(nèi)ATP合成障礙及氧化磷酸化失調(diào)等變化，這些變化又能進(jìn)一步造成細(xì)胞及線粒體的損傷從而加速細(xì)胞凋亡過程。

貓細(xì)小病毒在早期即侵害脾臟。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，在機(jī)體的免疫保護(hù)、免疫穩(wěn)定和免疫監(jiān)視中起重要作用。推測(cè)貓細(xì)小病毒選擇將脾臟作為早期的侵害對(duì)象，可削弱機(jī)體免疫保護(hù)能力，為進(jìn)一步增殖準(zhǔn)備。

早期感染時(shí)還發(fā)現(xiàn)貓細(xì)小病毒已侵害肝臟，造成肝臟內(nèi)白細(xì)胞受損，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及線粒體髓樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，肝臟是機(jī)體重要的解毒器官，但貓細(xì)小病毒選擇在早期侵害肝臟的具體原因還需進(jìn)一步研究。

3.3 貓瘟晚期病貓主要臟器的免疫組織化學(xué)研究 本試驗(yàn)通過對(duì)貓瘟病貓的主要器官進(jìn)行免疫組化染色從而確認(rèn)貓細(xì)小病毒抗原在組織中的分布情況。從染色的結(jié)果可以看出，貓細(xì)小病毒抗原在晚期貓瘟病貓的主要器官中的分布存在差異性。脾臟為強(qiáng)陽(yáng)性表明該器官中病毒分布最廣，病毒含量最高，這一結(jié)果再次驗(yàn)證了貓細(xì)小病毒主要侵害快速分化或快速分裂組織的特性。肝臟為陽(yáng)性，與病理組織學(xué)觀察的肝臟的嚴(yán)重病變一致。腎臟為弱陽(yáng)性，這與病貓可以通過尿液排毒的現(xiàn)象相符。肺為弱陽(yáng)性，表明貓細(xì)小病毒對(duì)肺臟侵害程度較小。腦為弱陽(yáng)性，與晚期病貓并未出現(xiàn)神經(jīng)癥狀相符。心為陰性[8]，提示心臟并非貓細(xì)小病毒的主要侵害的器官，這與臨床上很少見貓瘟病貓發(fā)生心衰等心臟問題的現(xiàn)象一致。晚期腸道出現(xiàn)陰性反應(yīng)與H.E.染色中觀察到的腸道組織的嚴(yán)重病變不符，推測(cè)可能存在假陰性，假陰性可由組織內(nèi)待測(cè)抗原的分解破壞、抗原含量過低、醛類固定劑對(duì)抗原的遮蓋、抗體質(zhì)量不佳或稀釋不當(dāng)、技術(shù)操作失誤等導(dǎo)致，這種推測(cè)有待進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

貓瘟對(duì)機(jī)體組織器官的損傷是多系統(tǒng)多器官性的，早期貓細(xì)小病毒主要損傷腸、脾、肝，其對(duì)脾臟的侵襲為后續(xù)侵害機(jī)體創(chuàng)造條件。貓瘟早期病貓的器官首先在腸、肝、脾出現(xiàn)病變；中期主要是腎、心、肺出現(xiàn)病變；晚期主要是腦出現(xiàn)病變。貓瘟晚期病貓腸道受到不可逆的損傷提示晚期的治療意義不大。