混合型貓傳染性腹膜炎自然病例的診斷和病理學觀察

王金玲，曹 霞，甘 迪，丁玉林，繆增強，楊龍峰，吉林臺

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.北京市延慶縣動物疫病預(yù)防控制中心，北京 延慶 102100)

貓傳染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是由貓冠狀病毒引起的一種全世界發(fā)生的致死性傳染病[1-2]。在貓舍內(nèi)，貓冠狀病毒感染率為100%，但只有5%～10%的感染貓可發(fā)展為FIP[3]。近些年，F(xiàn)IP的病例在世界上一直有報道，且發(fā)病率有上升趨勢。雖然多位國內(nèi)外研究者報道了FIP的病理變化，但觀點不同。為了闡明FIP的特征性病理變化，本試驗確診1例混合型FIP的自然病例，并進行系統(tǒng)的組織病理學觀察。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1只3歲臨床診斷為FIP的病死貓，由呼和浩特某寵物醫(yī)院贈予。

1.2 尸體剖檢及取材 通過問診貓主人和查閱醫(yī)師病歷記錄了解病死貓生前的臨床癥狀。按貓尸檢術(shù)式進行尸體剖檢和大體病變觀察，分別取全身各組織器官，大小為1.5 cm×1 cm×0.5 cm左右，固定于10%中性福爾馬林溶液中，用于組織病理切片制備。

1.3 組織切片制備和組織病理學觀察 固定好的組織進行修塊、脫水和透明，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，蘇木素-伊紅(H.E.)染色，制備病理組織切片和進行組織病理學觀察。

1.4 病毒的RT-PCR診斷和PCR產(chǎn)物測序

1.4.1 引物 FIP病毒的3′ UTR基因片段的特異引物[4-5]，上游引物為5′-GGCAACCCGATGTTTAAAACTGG-3′；下游引物為5′-CACTAGATCCAG-ACGTTAGCTC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 病毒RNA的提取 尸檢時取病死貓的小腸、脾臟和肝臟，分別提取各組織的總RNA，具體操作步驟按照RnaExTMTotal RNA istolation solution(GK3005,GENERAY BIOTECH)說明書進行。

1.4.3 病毒基因組RNA的擴增 cDNA合成：按PrimeScriptTMRT Master Mix(RR036A,TaKaRa BIO INC.)說明書操作。反應(yīng)體系(10 μL)：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，total RNA 4 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，產(chǎn)物4 ℃保存。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Per Mix 25 μL，dd H2O 19 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，輕輕混勻。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min：95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.4 PCR產(chǎn)物測序和同源性分析 PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行比對。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 發(fā)病貓為3周歲，逐漸表現(xiàn)精神沉郁，食欲降低，體溫39.3 ℃，腹圍逐漸增大，觸診腹部腹腔內(nèi)有大量腹水。發(fā)病后期精神極度沉郁，臥地不起，可視黏膜和皮膚明顯黃染，經(jīng)過1個月的治療，無任何效果而死亡。

2.2 大體病變 病死貓腹圍明顯膨大，觸診腹壁有明顯的波動感。全身各組織器官因嚴重黃疸而呈黃色。腹部皮膚真皮內(nèi)表面有較多的大小不等的圓形出血斑點。腹腔內(nèi)充滿淡黃色半透明較黏稠的腹水，腹腔漿膜面彌漫地附著一層薄厚不均的污黃色膠胨樣滲出物，大量界限明顯的黃白色針尖大小至小米粒大小的結(jié)節(jié)附著在漿膜面上，一部分結(jié)節(jié)埋藏在黃色膠胨樣滲出物內(nèi)，一部分結(jié)節(jié)相互融合成片，腹腔漿膜面凸凹不平(見封三彩版圖1,2,3)。局部腹腔漿膜面附著黃色絮狀滲出物和散在出血斑點。肝臟腫大，表面呈 “檳榔肝”紋理和散在黑紅色小米粒大小的出血斑點。肺臟腫脹，輕度實變，表面濕潤有光澤，表面和切面分布彌漫性和融合性的質(zhì)度較實的暗紅色肺炎灶。氣管內(nèi)充滿白色泡沫樣液體。心肌呈粉白色，心耳外膜散在出血斑點。腎臟腫大，淤血，皮質(zhì)呈土黃色，無光澤。腸系膜淋巴結(jié)腫大，呈黑紅色。腦水腫明顯。

2.3 組織病理學變化 胃、腸(封三插彩版圖4)、肝臟、脾臟(見封三彩版圖5)、胰腺、腎臟、腸系膜和膀胱等器官漿膜面均有一厚層漿液纖維素性滲出物附著，滲出物內(nèi)有大小不一的炎性細胞浸潤灶(眼觀結(jié)節(jié))。浸潤灶內(nèi)主要有大量淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和少量中性粒細胞，偶見細胞分裂象和少量細胞壞死，較大的浸潤灶內(nèi)和邊緣可見少量小血管和成纖維細胞增生。腹腔器官漿膜面間皮細胞增生，體積增大，數(shù)量增多，呈多形態(tài)向臟器表面增生(見封三彩版圖6)。心肌染色變淡，局部心肌纖維間可見淋巴細胞小浸潤灶。肝臟明顯淤血和水腫，狄氏腔顯現(xiàn)，局部有出血灶，肝細胞普遍發(fā)生輕度至中度脂肪變性，局部肝被膜下可見大小不等的淋巴細胞浸潤灶。腎小管上皮嚴重腫脹和脂肪變性，局部腎小管上皮細胞壞死，腎間質(zhì)多見淋巴細胞浸潤灶。肺淤血，肺泡間隔增寬，少量淋巴細胞浸潤，間質(zhì)成纖維細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞輕度增生，部分肺泡腔內(nèi)充滿漿液和不同數(shù)量的巨噬細胞。胰腺小葉邊緣腺泡壞死和間質(zhì)淋巴細胞增生明顯。小腸黏膜嚴重壞死。小腦浦金野細胞和大腦神經(jīng)細胞均有明顯的變性和壞死，小血管周圍出血灶多見。

2.4 RT-PCR結(jié)果 從肝臟、脾臟和小腸組織提取的RNA進行RT-PCR，均獲得220 bp左右的目的DNA片段(見圖7)。

圖7 FIP病毒的RT-PCR鑒定

2.5 RT-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果和同源性分析 RT-PCR產(chǎn)物測序后，從肝臟、脾臟和小腸分別獲得相互同源率為100%的220 bp左右的基因序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，與Feline coronavirus UU17(序列號:HQ012367)有最高同源性，同源率為99%。

3 討論

目前，對于FIP的死后確診主要是通過病理學與病毒抗原檢測[6]。FIP有2種類型，分別為濕型(滲漏型)和干型(非滲漏型)[7]。干型FIP特征病變是在組織器官的漿膜面和實質(zhì)內(nèi)的結(jié)節(jié)性病變(肉芽腫)；濕型FIP的特征病變?yōu)樾馗骨粌?nèi)大量腹水形成。在獸醫(yī)臨床上，同時表現(xiàn)干型和濕型FIP病理變化的混合型FIP更常見[8]。

該例混合型FIP特征性大體病變?yōu)楦骨粌?nèi)充滿淡黃色半透明較黏稠的腹水，腹腔漿膜面彌漫地附著大量界限明顯的黃白色小米粒大小的結(jié)節(jié)和一層薄厚不均的污黃色膠胨樣滲出物。RT-PCR、測序和基因比對結(jié)果表明：所獲得的FIP病毒特異性基因片段與Feline coronavirus UU17(序列號HQ012367)有最高同源性(99%)。

目前，針對干型FIP病例漿膜上出現(xiàn)結(jié)節(jié)的病理組織學國內(nèi)外研究者觀點不同。Kipar A,Weiss R C和Crawford A H等認為結(jié)節(jié)為肉芽腫性炎和/或化膿性肉芽腫性炎[8-10]，Evermann J F報道結(jié)節(jié)是由淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和中性粒細胞所圍繞的纖維素壞死性病灶[11]，蔣劍成等報道結(jié)節(jié)為滲出的脂肪空泡[12]和喬明明等報道結(jié)節(jié)為肉芽腫病變[5]。在病理學上，肉芽腫是一個組織有序的上皮樣細胞(巨噬細胞)聚集性炎灶[13-14]。能引起肉芽腫病變的病因主要為傳染性病原(細菌、真菌和寄生蟲)和外源性物質(zhì)(縫線和異物等)。根據(jù)病因不同，肉芽腫可能含有淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、多核巨細胞、成纖維細胞和膠原纖維(纖維化)。到炎癥后期，傳染性病原引起的肉芽腫中央常形成干酪樣壞死灶，壞死灶的周圍是由上皮細胞和多核巨細胞組成的特殊肉芽組織，肉芽腫的邊緣為結(jié)締組織[15]。

通過對本例組織病理學觀察，作者認為腹腔漿膜面的結(jié)節(jié)是伴有漿液-纖維素性滲出的無有序結(jié)構(gòu)的含有大量淋巴細胞、巨噬細胞[16]，漿細胞和少量中性粒細胞浸潤的炎性細胞浸潤灶，有的炎性細胞浸潤灶內(nèi)伴有輕度的纖維化，而非肉芽腫病變和脂肪空泡。同時，本試驗還觀察到以肺小葉間質(zhì)成纖維細胞和Ⅱ型肺上皮細胞輕度增生為特征的間質(zhì)性肺炎，以淋巴細胞增生和浸潤為特征的間質(zhì)性肝炎、間質(zhì)性心肌炎、間質(zhì)性胰腺炎和間質(zhì)性腎炎。