白術(shù)多糖對環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠白細胞數(shù)量及功能的修復作用

相雪蓮，許丹寧，曹 楠，錢 隆，田允波，李婉雁

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510225)

規(guī)?；B(yǎng)殖作為未來養(yǎng)殖模式的主流，對動物疫病的防控提出了更高的要求，因此，開發(fā)無毒、無殘留的免疫調(diào)節(jié)劑以提高動物機體的抗病能力顯得尤為重要。白術(shù)多糖(Polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)作為中藥白術(shù)的主要有效成分，可提高動物機體免疫力，并具有抗炎、抗腫瘤、抗應(yīng)激等作用[1]。大量前期研究結(jié)果表明，PAMK具有提高免疫器官指數(shù)、提高淋巴細胞增殖和轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)細胞因子的分泌及糾正T淋巴細胞亞群分布紊亂等免疫活性效應(yīng)[2-4]，但關(guān)于對免疫抑制動物白細胞形態(tài)和功能方面的報道較少。據(jù)此，本試驗利用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)小鼠模型，初步探討了PAMK對免疫抑制小鼠白細胞數(shù)量、形態(tài)及功能的影響，為多糖類免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只5周齡SPF級昆明小鼠，雌性，購自南方醫(yī)科大學動物科學實驗中心。

1.2 試驗分組及處理 小鼠隨機分為4組，每組15只，分別為對照組(N)、環(huán)磷酰胺組(H)、白術(shù)多糖組(B)和白術(shù)多糖+環(huán)磷酰胺組(BH)。B組和BH組小鼠灌胃PAMK 200 mg/(kg·bw)，另兩組灌胃生理鹽水0.5 mL，1次/d，連續(xù)28 d。H組和BH組小鼠在29 d、30 d、31 d連續(xù)腹腔注射CTX 80 mg/(kg·bw)，另兩組小鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水。35 d采集樣品并保存。

1.3 主要儀器 全自動酶標儀(ELX800)，購自美國博騰儀器公司；分光光度計(UV-3100)，購自MAPADA 公司；定量溶光光度分析儀(T6)，購自北京普析有限公司；比濁儀(Wi94748)，購自東西儀科技有限公司；生化培養(yǎng)箱(HCS-65A-A)，購自廣州恒創(chuàng)有限公司；透射電子顯微鏡(JEM-1400)，購自日本電子株式會社公司；光學顯微鏡(ECLIPSE E100)，購自Nikon公司。

1.4 主要藥品和試劑 白術(shù)多糖(20160323)，購自西安天園生物制劑廠；注射用環(huán)磷酰胺(H14023686)，購自山西普德藥業(yè)有限公司；金黃色葡萄球菌(FSCC223005)，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；ELISA試劑盒(XY-ELA9021)，購自上海心語生物科技有限公司；豚鼠血清(HQ30076)，購自廣東鴻泉生物科技有限公司；綿羊紅細胞(HQ80073)，購自廣東鴻泉生物科技有限公司；瑞士-吉姆薩染液(416093)，購自珠海貝索生物技術(shù)公司；H.E.染液(DH0006)，購自LEAGENE公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品采集及預處理 采集樣品前，小鼠禁食12 h，禁水6 h，乙醚麻醉，剪去尾尖，取約2 μL血液制備血涂片，瑞氏-吉姆薩法染色，光學顯微鏡下觀察白細胞，取400倍30個視野，計算白細胞總數(shù)，計數(shù)200個白細胞用于比例計算；眼靜脈取血分別制備抗凝血及血清，用于相關(guān)指標檢測；快速收取1～3 mm3的脾臟、胸腺組織置于2.5% 戊二醛溶液保存，送廣州金域醫(yī)學檢驗中心制備透射電鏡切片及拍照觀察；取小鼠左側(cè)股骨置于福爾馬林溶液浸泡保存，用于石蠟切片制備。

1.5.2 中性粒細胞吞噬能力測定 將新鮮抗凝血和金黃色葡萄球菌液以2∶1比例混合，置37 ℃水浴30 min，每隔15 min輕輕搖晃均勻。室溫下3 000 r/min離心10 min。吸取約3 μL中間白細胞層液體，制備白細胞涂片，瑞氏-吉姆薩法染色，計數(shù)100個中性粒細胞，用于中性粒細胞吞噬百分比及吞噬指數(shù)計算，公式如下：

1.5.3 血清中IL-2濃度檢測 按ELISA試劑盒操作說明書進行IL-2濃度的測定。

1.5.4 B淋巴細胞產(chǎn)生抗體能力檢測 小鼠腹腔注射綿羊紅細胞，處理5 d后，無菌摘取脾臟，分離淋巴細胞，臺盼藍染色檢測細胞活性在95%以上，將細胞濃度調(diào)整為5×106個/mL，淋巴細胞懸液10 μL 取加入體積分數(shù)為10%的綿羊紅細胞0.5 mL，補體1 mL，37 ℃水浴30 min，2 000 r/min離心10 min，取上清，分光光度計波長413 nm處測定OD值。

1.5.5 統(tǒng)計分析 采用Prism 5.0(GraphPad Software，CA，USA)軟件處理數(shù)據(jù)，選擇單因素方差分析，Tukey多重比較法進行多組間差異比較，文中數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，股骨組織切片采用CCD顯微成像分析系統(tǒng)進行拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)多糖對小鼠外周血白細胞數(shù)量以及比例的影響 結(jié)果如表1所示，小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導后，外周血中白細胞數(shù)量和淋巴細胞比例與對照組相比顯著下降(P<0.05)，中性粒細胞百分比顯著上升(P<0.05)，單核細胞及嗜酸性粒細胞比例無明顯變化(P>0.05)。白術(shù)多糖組小鼠的白細胞數(shù)量及比例與對照組差異不顯著(P>0.05)，灌服白術(shù)多糖能顯著提高免疫抑制小鼠的白細胞數(shù)量(P<0.05)，但仍低于對照組及白術(shù)多糖組(P<0.05)，對淋巴細胞及中性粒細胞比例也無明顯影響(P>0.05)。

表1 白術(shù)多糖對小鼠白細胞數(shù)量及比例的影響

2.2 白術(shù)多糖對小鼠胸腺、脾臟超微結(jié)構(gòu)的影響 從圖1可以看出，對照組及白術(shù)多糖組小鼠胸腺組織致密，細胞排列有序(圖1A，1E)，可見發(fā)育不同時期的胸腺細胞及胸腺上皮細胞，胸腺細胞核內(nèi)易染色質(zhì)呈團塊狀沿核周分布，核質(zhì)比高，胞膜上突起少，細胞器較少(圖1B，1E)。免疫抑制小鼠胸腺組織中，正常細胞數(shù)量明顯減少(圖1C)，胸腺細胞核內(nèi)染色質(zhì)多出現(xiàn)邊集，可見凋亡小體、髓樣小體及變性泡狀結(jié)構(gòu)(圖1D)，并伴有電子密度顆粒沉積。灌胃白術(shù)多糖可明顯增加免疫抑制小鼠胸腺組織密度(圖1G)，胸腺細胞形態(tài)正常，但胸腺細胞胞漿內(nèi)細胞器多于對照組及白術(shù)多糖組，仍有細胞凋亡現(xiàn)象(圖1H)，未見髓樣小體，整體細胞狀態(tài)較免疫抑制小鼠有明顯好轉(zhuǎn)。

圖2表明，對照組及白術(shù)多糖組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，可見T淋巴細胞(圖2F)、漿細胞(圖2B)、中性粒細胞、單核細胞等，細胞形態(tài)規(guī)則，偶見凋亡初期細胞(圖2A，2E)。環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)明顯異常，細胞數(shù)量減少，細胞核電子密度降低，染色質(zhì)減少，可見較多細胞凋亡(圖2D)，染色質(zhì)邊集、核固縮現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)大量巨型轉(zhuǎn)化淋巴細胞(圖2C)，胞漿內(nèi)充滿大量擴展、泡狀光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞核異型度高，多核。灌胃白術(shù)多糖對免疫抑制小鼠的脾臟結(jié)構(gòu)有明顯修復作用，組織致密性增加(圖2G)，巨型轉(zhuǎn)化淋巴細胞及凋亡細胞數(shù)量明顯減少，但胞漿中細胞器損傷仍較嚴重(圖2H)。

2.3 白術(shù)多糖對小鼠股骨骨髓細胞的影響 封二彩版圖3結(jié)果顯示，對照組和白術(shù)多糖組小鼠股骨組織結(jié)構(gòu)正常，骨髓細胞數(shù)量多，粒細胞系、紅細胞系、淋巴細胞系的細胞發(fā)育良好(封二彩版圖3A，3B，3E，3F)，環(huán)磷酰胺誘導小鼠的股骨組織疏松，各系細胞及巨核細胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)脂肪空泡，細胞核淡染，染色質(zhì)缺失，成熟紅細胞數(shù)量也明顯減少(封二彩版圖3C，3D)。添加白術(shù)多糖以后，環(huán)磷酰胺組小鼠骨髓結(jié)構(gòu)有了明顯的改善，骨髓細胞數(shù)量增多，但細胞核淡染現(xiàn)象依舊比較嚴重(封二彩版圖3G，3H)。

2.4 白術(shù)多糖對小鼠白細胞功能的影響 由圖4可知，和對照組相比，環(huán)磷酰胺組小鼠的中性粒細胞吞噬百分數(shù)、中性粒細胞吞噬指數(shù)、IL-2濃度以及B淋巴細胞分泌抗體量水平均顯著降低(P<0.05)。白術(shù)多糖可以顯著提高免疫抑制小鼠的中性粒細胞吞噬能力、血清中IL-2含量以及B淋巴細胞分泌抗體水平(P<0.05)，達到對照組水平(P>0.05)，而白術(shù)多糖還可以顯著提高正常小鼠淋巴細胞分泌細胞因子及抗體能力(P<0.05)。

圖4 PAMK對免疫抑制小鼠白細胞功能的影響

3 討論

環(huán)磷酰胺是制備免疫抑制動物模型的常用藥物，通過抑制骨髓造血干/祖細胞，引起白細胞減少癥，導致免疫功能低下[5-6]。本試驗采用80 mg/(kg·bw)劑量CTX誘導小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠外周血中白細胞數(shù)量急劇減少，白細胞比例紊亂，骨髓細胞損傷嚴重，胸腺及脾臟中死亡及凋亡細胞明顯增多，對T、B淋巴細胞及中性粒細胞的功能也有強烈的抑制作用，這與許多相關(guān)領(lǐng)域的研究結(jié)果一致[7-9]。

白細胞是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分，起源于骨髓造血干細胞，在骨髓及胸腺中發(fā)育分化后，在血液及脾臟中執(zhí)行功能，計算白細胞數(shù)量及比例是評估免疫功能的有效方法。本試驗結(jié)果顯示，白術(shù)多糖對正常小鼠白細胞的數(shù)量及比例無明顯干預作用，對免疫抑制小鼠外周血中白細胞數(shù)量有明顯的提升作用，但不能改變淋巴細胞及中性粒細胞比例紊亂現(xiàn)象，這可能與環(huán)磷酰胺的免疫抑制機制有關(guān)。環(huán)磷酰胺作為治療癌癥、自身免疫及免疫介導疾病的藥物，主要免疫抑制機制是使T、B淋巴細胞絕對數(shù)目減少[5]，這種機制除了通過抑制骨髓造血干細胞外，對外周血中成熟的淋巴細胞更具有直接殺傷效果。而白術(shù)多糖作為一種調(diào)節(jié)性免疫增強劑，并不能徹底糾正這種免疫抑制現(xiàn)象。試驗數(shù)據(jù)盡管沒有統(tǒng)計學意義，但能看出淋巴細胞百分比有上升的趨勢。Li W Y等在研究中也發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖可以糾正因環(huán)磷酰胺所致的雛鵝白細胞比例失衡，并能明顯提高T、B淋巴細胞的體外增殖能力[10]，還有其他一些中草藥活性物質(zhì)也都能夠明顯改善環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠白細胞減少現(xiàn)象[11-12]。

骨髓、胸腺及脾臟是白細胞發(fā)育、分化及執(zhí)行功能的場所。骨髓組織在環(huán)磷酰胺的作用下，骨髓細胞數(shù)量明顯減少，相對淋巴系及紅系細胞而言，粒細胞系損傷最輕，而白術(shù)多糖能夠明顯增加骨髓細胞的數(shù)量，從而拮抗環(huán)磷酰胺的抑制作用。胸腺是T淋巴細胞發(fā)育分化場所，超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺對胸腺細胞的破壞程度最嚴重，主要體現(xiàn)在不同發(fā)育時期淋巴細胞的數(shù)量急劇減少、凋亡及壞死現(xiàn)象增多。進行白術(shù)多糖干預后，胸腺細胞的數(shù)量明顯增多，細胞形態(tài)有明顯的改善，凋亡細胞數(shù)量也顯著減少。脾臟在環(huán)磷酰胺的作用下出現(xiàn)了大量的巨型轉(zhuǎn)化淋巴細胞及凋亡細胞，說明環(huán)磷酰胺對淋巴細胞的破壞最嚴重，而白術(shù)多糖能夠明顯減少巨型轉(zhuǎn)化淋巴細胞的數(shù)量，并能使脾臟中的淋巴細胞保持正常形態(tài)，同時也減少了壞死和凋亡的細胞，綜合分析發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖對造血及免疫器官中淋巴細胞的修復作用比較顯著，但對淋巴細胞總量的提升作用不明顯。

白術(shù)多糖雖然對正常小鼠白細胞數(shù)量、比例及組織細胞沒有正向或負向的干預作用，但對正常小鼠的T、B淋巴細胞功能有顯著的促進作用。T淋巴細胞是IL-2的主要產(chǎn)生者，IL-2的分泌水平是衡量T淋巴細胞功能的重要指標，同時IL-2對胸腺中的調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)育也有重要影響[13]，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖對正常小鼠血清中IL-2的含量有明顯的提升作用，從而可以推斷，白術(shù)多糖對胸腺中T細胞的分化也有一定的促進作用。體液免疫主要是通過B淋巴細胞轉(zhuǎn)化成漿細胞分泌抗體及激活相關(guān)免疫細胞分泌細胞因子來發(fā)揮作用，B淋巴細胞表面有免疫球蛋白(BCR)，特異抗原只能和相應(yīng)的受體結(jié)合才能發(fā)揮作用，因此B淋巴細胞產(chǎn)生抗體量是衡量體液免疫的重要指標。已有研究發(fā)現(xiàn)，多糖可以提高機體的體液免疫功能，例如玉屏風多糖能夠提高綿羊紅細胞處理時B淋巴細胞分泌的抗體量，從而提高小鼠的體液免疫功能[14]。而白術(shù)多糖也能夠顯著高正常小鼠B淋巴細胞分泌抗體的能力，上述研究結(jié)果證實了在正常生理條件下，白術(shù)多糖通過提高淋巴細胞的功能，從而增強機體的特異性免疫功能。李鵬等[15]也從血清抗體的測定、脾淋巴細胞的轉(zhuǎn)化能力角度證實了白術(shù)多糖對正常小鼠特異性免疫具有調(diào)節(jié)作用。

白術(shù)多糖對免疫抑制小鼠的白細胞功能則表現(xiàn)出了明顯的正向調(diào)節(jié)作用，4種指標均恢復至對照組水平。中性粒細胞的吞噬指標是評定功能的重要指標，吞噬能力越強，則代表中性粒細胞的功能越完善，能夠在短時間內(nèi)發(fā)揮強大的防御作用。白術(shù)多糖雖然不能提升正常小鼠中性粒細胞的吞噬能力，但可增強免疫抑制小鼠的中性粒細胞功能，原因可能是白術(shù)多糖可以明顯修復骨髓粒細胞系，增加了外周血中中性粒細胞的數(shù)量并增強其活力。試驗結(jié)果進一步顯示，在機體免疫功能低下時，白術(shù)多糖能從非特異性和特異性免疫角度全面改善機體的防御能力，顯示出了強大的免疫促進作用。

綜上所述，白術(shù)多糖可以通過提高白細胞數(shù)量、修復骨髓、脾臟及胸腺的組織結(jié)構(gòu)、提高白細胞功能等途徑減輕環(huán)磷酰胺對小鼠白細胞的抑制和破壞作用，并對正常小鼠的淋巴細胞功能具有明顯的提升作用。本試驗初步探索了白術(shù)多糖對免疫抑制小鼠白細胞的保護作用，為進一步研究白術(shù)多糖的作用機制及臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。