豬流行性腹瀉病毒抗原免疫層析檢測方法的建立與臨床應(yīng)用

張艷萍 , 王會勤 , 馬 鵬 , 劉芮祎，賀南航

(廣東愛蘇生物科技有限公司，廣東 廣州 510320)

自2010年以來，由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬流行性腹瀉在我國多省份廣泛流行，且反復(fù)暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。引起豬病毒性腹瀉的病原主要包括豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬輪狀病毒A(PRoVA)，3種病毒所引起的腹瀉癥狀相似，易造成漏診和誤診[1]，因此建立PEDV病原快速檢測方法意義重大。

目前，豬流行性腹瀉病毒常用的檢測方法包括PCR、ELISA、病毒分離、血清學(xué)試驗等[2]。檢測樣本一般為腹瀉豬的糞便或嘔吐物，病死豬的小腸內(nèi)容物等。PCR、ELISA 方法需要專業(yè)儀器，較適合實驗室診斷，不便于豬場現(xiàn)場檢測。膠體金免疫層析方法(Gold immunochromatographyassy，GICA)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型體外診斷技術(shù)，運用肉眼可見的標(biāo)記物(膠體金或染色乳膠)而得到直觀的實驗現(xiàn)象(顯色)，使得這種分析技術(shù)具備操作快速簡便、無需儀器、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏，可常溫下運輸保存等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。

本試驗采用本公司在人類疾病體外檢測領(lǐng)域業(yè)已成熟的膠體金免疫層析技術(shù)，建立豬流行性腹瀉病毒檢測方法，將膠體金免疫層析檢測方法與豬場病原現(xiàn)場檢測技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)基層獸醫(yī)隨時進行活體豬只體檢和診斷的目標(biāo)，實時監(jiān)控豬場疫病疫情，及時指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體(mAb)PEDV-B1、PEDV-B2、羊抗鼠IgG多抗，均購自長沙優(yōu)異特生物科技有限公司；豬流行性腹瀉病毒RT-PCR試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司。豬流行性腹瀉病毒疫苗，購自福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，批號為2018006。豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬德爾塔冠狀病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性病料，均由中山大學(xué)生命科學(xué)院郭春和博士實驗室提供，現(xiàn)場檢測。

二水合檸檬酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和碳酸鉀，均為廣州化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。氯金酸、BSA、蔗糖，均購自Sigma公司。鋁箔袋、塑料卡、吸水紙、PVC 底板，均為上海捷寧生物科技有限公司產(chǎn)品；聚酯膜、玻璃纖維素膜，均為上海金標(biāo)公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜，上海杰一生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設(shè)備 三維平面點膜噴金儀HM3030、CM4000 型切條機，上海金標(biāo)生物科技有限公司；高速冷凍離心機H-2100R，長沙湘儀離心機儀器有限公司；紫外連續(xù)掃描分光光度計，Thermo公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；C1000 Touch PCR儀,Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金溶液的制備 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，根據(jù)膠體金制備原理[3]，通過在制備過程中改變添加檸檬酸三鈉的量來改變膠體金顆粒粒徑的大小。在圓底燒瓶中加入500 mL超純水加熱至煮沸，加入10 mL 1%氯金酸溶液，10 min 后加入12 mL 1% 檸檬酸三鈉溶液，此時溶液顏色由黑色逐漸變?yōu)榫萍t色。繼續(xù)煮沸10 min 后停止加熱，冷卻至室溫，4 ℃貯存。紫外分光光度計掃描檢測膠體金溶液質(zhì)量。

1.3.2 抗原最佳標(biāo)記濃度與最佳包被濃度的確定 取1 mL 膠體金溶液，以4為梯度距離加入4～24 μL濃度為0.1 mol/L的碳酸鉀(K2CO3)溶液調(diào)節(jié)pH，固定PEDV單抗B1添加量為0.02 mg/mL, 以膠體金與抗體反應(yīng)10 min最低K2CO3濃度作為最佳標(biāo)記pH。

用確定的最佳標(biāo)記pH，將PEDV單抗B1分別按照0.01、0.02 mg/mL和0.04 mg/mL標(biāo)記。PEDV單抗B2分別按照0.8、1.0 mg/mL和1.2 mg/mL 包被在T 線位置，進行正交試驗，檢測PEDV陽性樣本、弱陽性樣本和陰性樣本。選擇弱陽性樣本顯色明顯且陽性病毒樣本與弱陽性病毒樣本顯色差異最大的組合為最佳條件。在此條件下，羊抗鼠IgG 分別按照0.5、0.8、1.0 mg/mL和1.2 mg/mL包被在C 線位置，檢測PEDV陽性樣本，選擇C線顯色強度與T線相當(dāng)?shù)陌粷舛葹樽罴褩l件。

1.3.3 PEDV檢測卡的制備 將包被有PEDV單抗B2和羊抗鼠IgG 的硝酸纖維素膜、噴有PEDV單抗B1偶聯(lián)膠體金的聚酯墊、玻璃纖維濾紙與吸水紙組裝在PVC底板上，用切條機切成4.0 mm寬的試紙條，裝入檢測卡殼中，即為最終的檢測卡。

1.3.4 檢測方法的確定 將PEDV陽性、弱陽性、陰性樣本分別取50、80、100 μL和150 μL加到加樣孔中，室溫反應(yīng)10、15、20 min和30 min觀察結(jié)果，確定加樣量及反應(yīng)時間。

1.3.5 結(jié)果判定方法的建立 用檢測卡檢測PEDV樣本，檢測卡窗口僅在C區(qū)出現(xiàn)1條紅色反應(yīng)線，結(jié)果為陰性；T區(qū)和C區(qū)均出現(xiàn)1條紅色反應(yīng)線，結(jié)果為陽性；若C區(qū)無紅色反應(yīng)線出現(xiàn)，表示結(jié)果無效，建議用新檢測卡重新進行檢測。

1.3.6 檢測卡特異性檢測 用PEDV檢測卡分別檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒，確定本檢測卡的特異性。

1.3.7 檢測卡靈敏度檢測 用500 μL 病毒含量為1.0×105.7TCID50/mL的PEDV 細(xì)胞毒倍比稀釋來檢測制備的檢測卡的靈敏度。測定該檢測卡能檢出的最高稀釋倍數(shù)對應(yīng)的病毒含量。

1.3.8 檢測卡重復(fù)性及加速穩(wěn)定性檢測 用PEDV陽性、陰性樣本檢測PEDV試紙條的批內(nèi)及批間穩(wěn)定性，每份樣本重復(fù)檢測10次，考察其重復(fù)性。將檢測卡放置于50 ℃溫箱中，每周檢測1次，考察檢測卡的熱加速穩(wěn)定性。

1.3.9 臨床樣本檢測 通過收集在廣東、廣西等發(fā)生腹瀉的豬場臨床糞便樣本，隨機選取80份腹瀉豬的糞便樣本，分別用豬流行性腹瀉RT-PCR試劑盒、本文制備的PEDV檢測卡檢測。

2 結(jié)果

2.1 膠體金溶液掃描結(jié)果 以雙蒸水為對照，用紫外分光光度計在400～700 nm連續(xù)掃描，測定吸收曲線和吸收峰(見表1)。結(jié)果為λmax=531 nm，ODmax=0.168 0。所制備的膠體金顏色為透明的酒紅色，液面無油質(zhì)類漂浮物，可用于試紙條制備。

表1 膠體金溶液掃描結(jié)果(峰值附近部分)

2.2 抗原最佳標(biāo)記濃度與最佳包被濃度 膠體金中加入16 μL 0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH時，標(biāo)記抗原沒有死金或變紫現(xiàn)象，調(diào)節(jié)后的膠體金溶液的pH在8.0 左右。通過正式試驗，確定PEDV單抗B1按0.02 mg/mL 標(biāo)記，T線PEDV單抗B2按照1.0 mg/mL包被、C線羊抗鼠IgG 按照0.5 mg/mL包被為最佳條件組合。

2.3 檢測卡的制備與組裝 該檢測卡由采集部件與檢測部件2個部分組合而成。為一種具有特殊結(jié)構(gòu)與材質(zhì)的開孔型槳形采集器，具備較強的親水性能與快速傳輸液態(tài)樣本的能力。本品采集活體待檢豬糞便樣本后，在洗脫液的配合下，糞便樣本中體積較大物質(zhì)被阻止在采集器表面或脫落至展開劑中，體積較小物質(zhì)(如水、無機鹽、病毒、細(xì)菌、蛋白類等)則可順利通過采集器，傳輸至檢測部件。檢測部件即組裝好的試紙條部分、上蓋和底蓋(如圖1)，最后通過焊接機將4個部分壓緊即可。

圖1 PEDV檢測卡組成

2.4 樣品檢測方法的確定 通過對比不同加樣量和反應(yīng)時間對檢測結(jié)果的判定影響，最終確定將樣本80～100 μL加到加樣孔中，室溫反應(yīng)15 min，為樣本的檢測條件。

2.5 結(jié)果判定方法的建立 用檢測卡檢測PEDV陰性樣本，檢測卡窗口僅在C區(qū)出現(xiàn)1條紅色反應(yīng)線，結(jié)果為陰性。檢測PEDV陽性樣本和弱陽性樣本，T區(qū)和C區(qū)均出現(xiàn)1條紅色反應(yīng)線，結(jié)果為陽性，T線顯色無論深淺均代表樣本中含有PEDV，提示豬流行性腹瀉的發(fā)生。若C區(qū)未出現(xiàn)紅色反應(yīng)線，無論T區(qū)是否出現(xiàn)反應(yīng)線，該檢測卡結(jié)果均為無效，應(yīng)更換檢測卡重新測試。

2.6 檢測卡的特異性 用PEDV檢測卡分別檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(RV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。除了檢測自身PEDV為陽性以外，其他結(jié)果均為陰性，說明PEDV檢測卡與以上幾種常見病毒均無交叉反應(yīng)，特異性好。

2.7 靈敏度檢測 用1頭份/mL PEDV 疫苗(該批次的疫苗生產(chǎn)檢驗報告顯示PEDV實際病毒含量檢測結(jié)果為1.0×105.7TCID50/頭份)進行靈敏度檢測，用0.2 mol/L的PB緩沖液倍比稀釋，確定檢測卡的靈敏度。結(jié)果最低能檢測到稀釋104倍的病毒液，約100 TCID50的病毒量，如圖2所示。

圖2 PEDV檢測卡靈敏度檢測結(jié)果

2.8 檢測卡重復(fù)性結(jié)果及加速穩(wěn)定性檢測 從同批次試紙條中隨機抽取10根進行重復(fù)試驗，檢驗結(jié)果完全一致，符合率為100%。批內(nèi)和批間檢測重復(fù)性好(見圖3)。

圖3 批內(nèi)及批間重復(fù)性檢測結(jié)果

將檢測卡放置于50 ℃溫箱中，每周與常溫條件下存放的檢測卡對比檢測，結(jié)果檢測卡在50 ℃下保存10周其檢測結(jié)果無明顯差異，可依此確定檢測卡室溫保質(zhì)期最少為12個月。

2.9 臨床樣本檢測 用PCR試劑盒和膠體金檢測卡分別對來自廣東、廣西的80份腹瀉豬糞便樣本進行檢測。膠體金快速檢測卡檢測只需用樣本采集部件直接刮取糞便，然后插入1.0 mL的PB緩沖液中，等待15 min即可進行結(jié)果觀測；PCR檢測方法按照相應(yīng)試劑盒說明書進行操作。2種方法檢測結(jié)果見表2。

表2 PEDV病原PCR檢測與本文膠體金檢測卡檢測結(jié)果統(tǒng)計

以PCR檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，檢測卡的靈敏度為94.7%(36/38)，特異性為100%，Kappa值為0.949 7。結(jié)果表明，PEDV膠體金免疫層析檢測卡與PCR檢測具有很好的一致性，說明PEDV檢測卡用于獸醫(yī)現(xiàn)場篩查和確診病情具有很強的指導(dǎo)意義。

3 討論

PEDV抗原糞便免疫層析檢測卡將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫層析技術(shù)和樣本采集新技術(shù)結(jié)合起來，發(fā)展為一項新型體外診斷技術(shù)。該技術(shù)操作簡便，集臨床豬糞便樣本的采集和檢測于一體，無需另行處理樣本,如樣本洗脫、離心等，結(jié)果準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖生產(chǎn)。目前PEDV病原學(xué)檢測方法主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測，靈敏度高，但檢測結(jié)果相對于發(fā)病時間具有明顯滯后性，不利于養(yǎng)殖生產(chǎn)一線早期檢測該病，一旦發(fā)現(xiàn)問題立即進行緊急免疫和隔離防護的控制處理方針。所以，膠體金免疫層析快速檢測產(chǎn)品能很好的解決這一問題。目前，建立能同時檢測豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒等常見腹瀉病毒的快速檢測卡對于基層獸醫(yī)快速鑒別診斷幾種病毒性腹瀉病毒意義重大，這將是今后值得進一步研究的課題。靈敏度是衡量試紙條性能好壞的重要指標(biāo)，本試驗通過優(yōu)化膠體金標(biāo)記反應(yīng)條件、金標(biāo)稀釋液、樣品稀釋液和樣品墊的制備條件，最低能夠檢測到100 TCID50左右的病毒量，并且可以檢測到臨床樣本中的野毒。

通過臨床樣本檢測試驗證實:本文所建立的豬流行性腹瀉病毒膠體金免疫層析法檢測卡具有良好的靈敏度和特異性，與豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒等癥狀相似的疾病無交叉反應(yīng)；檢測卡與PCR檢測方法對比，結(jié)果一致性高達94.97%。同時試劑盒在常溫下至少可保存1年，對同一樣品的重復(fù)試驗結(jié)果一致，說明其具有較好的穩(wěn)定性。豬流行性腹瀉病毒膠體金免疫層析檢測卡使用方便、成本低，可用于豬場發(fā)生病毒性腹瀉疾病的快速檢測，適合基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖企業(yè)使用。