我國牛羊藍舌病血清學(xué)調(diào)查

朱 沛，肖 雷，苗海生，楊振興，謝佳芮，朱建波，李華春

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室 , 云南 昆明 650224)

藍舌病(Bluetongue,BT)是由藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的綿羊和其他家養(yǎng)及野生反芻動物的一種非接觸性烈性傳染病[1]。該病能引起發(fā)熱、白細(xì)胞減少、發(fā)紺、鼻腔和胃腸道黏膜嚴(yán)重的卡他性炎癥，并能引發(fā)妊娠母畜流產(chǎn)、死胎等，對養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失[2]。該病致死率為20%～30%，有時甚至高達90%[3]，由于BT對畜牧業(yè)和畜產(chǎn)品經(jīng)濟貿(mào)易的影響以及對社會經(jīng)濟大環(huán)境的潛在威脅，世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)將藍舌病列為法定上報的疫病，我國將其列為一類傳染病[4-5]。

藍舌病病毒為雙鏈RNA病毒，屬于呼腸孤類病毒科環(huán)狀病毒屬，它分布于全球大多數(shù)熱帶地區(qū)，并且分布范圍不斷擴大，散發(fā)于亞熱帶、溫帶地區(qū)，成為了世界性的傳染病[6-7]，目前全球已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的BTV共有27個血清型[8-10]。中國于1979年首次分離到BTV，目前已在我國的29 個省份檢測到感染BTV的病畜[11]，并已鑒定出7個血清型(BTV1、2、3、4、12、15、16)[12]，其中BTV1和BTV16為優(yōu)勢血清型[13]。雖然藍舌病還未在我國暴發(fā)過，但我國地域遼闊，氣候環(huán)境多樣，適合蟲媒病毒媒介生存繁殖的地域也很多，目前已發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)地區(qū)都存在該病毒的感染，且目前暫未出現(xiàn)能有效預(yù)防藍舌病的疫苗，由此可見，我國發(fā)生該病的風(fēng)險很大，開展大規(guī)模藍舌病血清學(xué)調(diào)查研究尤為迫切。本試驗采用BTV競爭酶聯(lián)免疫吸附法(C-ELISA)對2015-2017年我國重慶、新疆、西藏、湖北、河北、廣西、貴州、內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、四川、云南共12個省區(qū)的19 237份血清進行檢測，其結(jié)果將為我國藍舌病的風(fēng)險防控提供重要依據(jù)和參考[14]。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 血清樣品(n=19 237)由各省市(地區(qū))的動物防疫控制中心采集，常規(guī)分離，-20 ℃保存；BTV C-ELISA檢測試劑盒，由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供；BioTek ELX-800酶標(biāo)儀；AquaMax 2000洗板機，購自Molecular Devices公司。

1.2 血清BTV C-ELISA檢測 用本實驗室建立的BTV C-ELISA試劑盒檢測中國12個省62個地區(qū)的血清抗體水平，共計19 237份樣品，取試劑盒提供的ELISA板，每孔分別加入10 μL的待檢血清和陽性、弱陽性、陰性對照血清，每份樣品設(shè)2孔平行，置37 ℃溫育30 min后，用試劑盒提供的樣品稀釋液按照1∶100倍稀釋兔抗BTV抗體，每孔加50 μL，37 ℃ 溫箱里溫育60 min后，用PBST洗液洗板2次，拍干，按1∶1 000倍稀釋羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，每孔加50 μL；37 ℃溫箱里溫育30 min后，用PBST洗液洗板5次，拍干，每孔加入50 μL底物反應(yīng)液，37 ℃避光溫育10 min后，每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，15 min內(nèi)在酶標(biāo)儀450 nm波長下讀取OD值。

1.3 結(jié)果判定 當(dāng)2個陽性對照孔OD450≤0.2，2個孔間OD450 nm差距小于0.05，且2個陰性對照孔1.0≤OD450<1.6，2個孔間OD450差距小于0.2時，表明試驗成立，根據(jù)公式計算抑制率(PI)=(陰性對照OD450平均值-樣品血清OD450)/陰性對照OD450平均值×100%，當(dāng)抑制率≥50%時判為抗體陽性，否則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 BTV血清學(xué)調(diào)查 12個省區(qū)的BTV抗體平均陽性率見表1，結(jié)果表明，被調(diào)查地區(qū)的BTV血清陽性率呈現(xiàn)明顯地域特征，具體表現(xiàn)為低緯度地區(qū)普遍高于高緯度地區(qū)，植被豐富地區(qū)高于同緯度的其他地區(qū)。試驗結(jié)果顯示，BTV陽性率最高的3個省為廣西、重慶和云南，平均陽性率分別為38.14%、24.59%和23.34%，BTV陽性率最低的3個省為遼寧、吉林、河北，平均陽性率分別為4.33%、8.63%和9.87%，而緯度相近的內(nèi)蒙古地區(qū)BTV平均陽性率(10.88%)遠(yuǎn)高于旁省，說明了茂盛的植被與草場也是影響蟲媒病毒傳播的重要因素，另外，高海拔的西藏地區(qū)，BTV陽性率高達22.39%，可能的原因是被調(diào)查地區(qū)大多位于西藏東南地區(qū)的雅魯藏布江谷地，當(dāng)?shù)貧夂驕嘏瘽駶櫍瑸锽TV的媒介傳播創(chuàng)造了有利條件，致使當(dāng)?shù)嘏！⒀虻腂TV血清陽性率升高。

表1 我國部分省份牛羊血清樣品及檢測結(jié)果

2.2 不同動物BTV的感染率 本試驗對6個省份同一地區(qū)在同一時間采集的牛、羊血清進行檢測，來比較不同動物BTV的血清陽性率，結(jié)果表明(見表2)，除云南省外(牛42.3%、羊28.7%)，所有地區(qū)的羊血清陽性率(16.7%～62.6%)均高于牛(0～28.4%)；通過比較內(nèi)蒙古、新疆的綿羊和山羊的血清陽性率，可以得出2個地區(qū)綿羊血清的陽性率(36.0%、37.1%)均高于山羊(16.7%、24.1%)，綜上，BTV的易感程度綿羊>山羊>牛。

表2 不同動物BTV抗體陽性率比較

2.3 不同季節(jié)BTV的感染率 本試驗對云南省德宏、曲靖和普洱這3個地區(qū)不同季節(jié)采集的牛、羊血清進行檢測，結(jié)果顯示，牛、羊血清的BTV陽性率具有明顯的季節(jié)性(表3)，其中以第1季度(1～3月)平均陽性率最低，牛血清為0～13.3%，羊血清為6.7%～13.3%；第3季度(7～9月)平均陽性率最高，牛血清為38.3%～41.7%，羊血清為23.3%～46.7%；由于夏季濕熱的氣候利于蟲媒的繁殖和活動，導(dǎo)致血清陽性率在第2季度(4～6月)逐漸升高，其中牛血清第2季度(4～6月)BTV平均陽性率27.8%～28.9%，羊血清為15.6%～31.1%，到第3季度牛羊血清陽性率均達到最高值，到第4季度(10～12月)由于冬季氣溫低，蟲媒活動不頻繁，陽性率也隨之降低，其中牛血清平均陽性率為10.0%～16.7%，羊血清11.7%～20.0%。綜上，BTV牛羊血清陽性率第3季度>第2季度>第4季度>第1季度。

表3 不同季節(jié)BTV抗體陽性率比較

3 討論

藍舌病作為蟲媒病毒[15]，傳播媒介和儲存宿主較多，一種媒介又可以傳播多種病毒，增大蟲媒病毒的防控難度，且目前沒有有效的預(yù)防措施和治療方法，主要通過撲殺帶毒動物及防治蟲媒來阻止病毒的傳播；我國幅員遼闊，自然環(huán)境復(fù)雜，蟲媒病毒傳播媒介種類多，分布廣，危害嚴(yán)重，因此，系統(tǒng)地調(diào)查BTV在我國的血清學(xué)流行情況任務(wù)迫切。

本試驗選取了在氣候海拔等方面都極具代表性的12個省62個地區(qū)作為調(diào)查對象，從 2015-2017年的試驗結(jié)果顯示，被調(diào)查的12個省份均存在BTV的流行。

蟲媒病毒的流行性主要取決于蟲媒的活動情況[16]，極易受外界環(huán)境中溫度、濕度、海拔等因素影響，因此具有明顯的地域性和季節(jié)性。有研究表明，藍舌病主要存在于南緯35°到北緯40°的地區(qū)，本試驗調(diào)查的地區(qū)幾乎都在這個緯度區(qū)間內(nèi)，解釋了被調(diào)查的地區(qū)均存在BTV感染的現(xiàn)象。

本試驗調(diào)查的12個省(區(qū)、市)中，BTV抗體陽性率最低的3個地區(qū)是遼寧、吉林和河北，BTV年平均陽性率分別為4.33%、8.63%和9.87%，可能的原因是高緯度高寒地區(qū)不利于蟲媒的生存和繁殖，導(dǎo)致了BTV陽性率遠(yuǎn)低于其他地區(qū)，而相同緯度的內(nèi)蒙古自治區(qū)BTV年平均陽性率略高(10.88%)的可能原因是草場茂盛，而草地適宜的氣候和濕度為蟲媒的生長和繁殖創(chuàng)造了條件，導(dǎo)致其陽性率升高；而長江以南的大部分地區(qū)因為適宜的海拔和氣候條件使得BTV在當(dāng)?shù)厥⑿?，其中陽性率最高?個地區(qū)為廣西、重慶、云南，BTV年平均陽性率分別為38.14%、24.59%、23.34%，遠(yuǎn)高于全國年平均水平；值得注意的是，西藏作為高海拔高寒地區(qū)，BTV年平均陽性率也高達22.39%，可能的原因是染病動物通過貿(mào)易被帶到西藏地區(qū)，也可能是庫蠓適應(yīng)能力增強，變異出適應(yīng)高海拔、高寒環(huán)境的品種[17]，并且本試驗調(diào)查的拉薩及日喀則地區(qū)位于雅魯藏布江谷地，氣候溫暖濕潤，地勢較低，屬于熱帶山地氣候，適合蟲媒生長，為BTV傳播創(chuàng)造了條件。

本試驗通過對云南省德宏、曲靖、普洱三地不同季度采集的牛羊血清的檢測發(fā)現(xiàn)，山羊?qū)TV的感染率低于牛，與其他調(diào)查地區(qū)的結(jié)果相悖，可能的原因有幾個，首先云嶺牛的皮膚表面積大，被毛短，叮咬面積遠(yuǎn)大于山羊，增大了BTV感染的可能；其次云南省肉牛養(yǎng)殖量大，蟲媒通過長期叮咬牛已經(jīng)變異出適應(yīng)牛的品種，所以偏好于叮咬牛；另外云南的云嶺山羊品種不同于成都的麻羊、貴州白山羊等，也可能導(dǎo)致了BTV感染率上的差異。本試驗還發(fā)現(xiàn)BTV的流行具有明顯季節(jié)性，牛羊血清陽性率在第2季度(4～6月)逐漸升高，到第3季度(7～9月)達到頂峰，又在第4季度(10～12月)逐漸降低，以第1季度(1～3月)牛羊血清陽性率最低。由于BTV是蟲媒病毒，它的傳播依賴媒介，所以感染率與蟲媒活動密切相關(guān)，夏季天氣炎熱濕度又大，蟲媒活動頻繁，所以BTV陽性率在夏季逐漸升高，到秋季到達頂峰，隨著入冬氣溫下降陽性率又逐漸降低，到第1季度BTV血清陽性率呈現(xiàn)最低，呈明顯季節(jié)性。

本試驗通過對2015-2017年全國12個省62個地區(qū)共計19 237份血清樣品的調(diào)查研究，明確了藍舌病在被調(diào)查的地區(qū)均有流行，同時發(fā)現(xiàn)在中國西藏等高海拔寒冷地區(qū)，有藍舌病病毒和傳播媒介存在，值得進一步深入研究。本試驗調(diào)查范圍廣，樣本數(shù)量多，為了解中國各地區(qū)BTV的流行情況提供了血清學(xué)佐證，也為準(zhǔn)確評估藍舌病在我國的危害以及制定有效防治措施提供了可靠依據(jù)。