1株鴿源基因Ⅶ型新城疫強(qiáng)毒株的分離鑒定及全基因組分析

李夢(mèng)嬌，栗永華，楊 彬，徐智凱，王漢青，仇旭升，孫英杰，譚 磊，廖 瑛，宋翠萍，劉煒煒，丁 鏟，孟春春，吳艷濤

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 閔行 200241)

新城疫(Newcastle disease，ND)是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的病毒性傳染病，其宿主范圍非常廣泛，可以感染家禽、水禽和多種鳥類。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科，禽Avulavirus-1型，分別編碼3′-NP-P-M-F-HN-L-5′六種主要的結(jié)構(gòu)蛋白[1]。目前NDV可以分為Class I和Class II 兩大分支，ND自1926年暴發(fā)以來，共有四次大流行。其中第三次大流行主要是由鴿感染新城疫病毒引起，大多數(shù)鴿源NDV屬于基因VI型，特別是被稱為PPMV-1的VIb亞型[2-3]。

分子流行病學(xué)結(jié)果顯示，自20世紀(jì)90年代以來，危害我國家禽的NDV強(qiáng)毒主要為基因Ⅶ型[4]，且該型病毒在雞、水禽均有大量分離，但從鴿群中分離出基因Ⅶ型NDV卻少有報(bào)道[5]。2016年11月-2017年3月，上海嘉定地區(qū)發(fā)生了數(shù)起鴿感染NDV疑似病例，病鴿表現(xiàn)為精神沉郁，食欲下降，拉稀。隨后從發(fā)病的鴿群中采集泄殖腔棉拭子接種SPF雞胚進(jìn)行病原的分離，通過血凝和血凝抑制試驗(yàn)從中鑒定出1株鴿源新城疫病毒(NDV)，并將其命名為Pigeon/China/SHJD13/2017。初步鑒定后該病毒屬于基因Ⅶ型，為了更好地解析NDV的跨種間傳播規(guī)律，本試驗(yàn)對(duì)此鴿源基因Ⅶ型NDV進(jìn)行了3次噬斑純化后測定其全基因組序列，著重比較了毒力基因的點(diǎn)突變規(guī)律；還通過雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)、腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)等指標(biāo)的測定對(duì)其毒力進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，以期為ND的防控提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒 鴿源新城疫病毒Pigeon/China/SHJD13/2017，分離自上海嘉定發(fā)病鴿群。對(duì)發(fā)病的鴿群采集泄殖腔棉拭子接種SPF雞胚進(jìn)行病原的分離，經(jīng)3次噬斑純化后用于后續(xù)病毒的全基因組序列測定以及生物學(xué)特性分析。

1.2 SPF雞胚以及SPF雞 SPF雞胚，購自北京梅里亞動(dòng)物保健有限公司;1日齡SPF雛雞由本實(shí)驗(yàn)室自行孵化。

1.3 分子生物學(xué)試劑 TRIzol LS Reagent試劑，購自Life Technologies Corporation公司；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、5×AMV Buffer、dNTPs、RNA酶抑制劑(PRI)、pMD19-T載體，均購自寶生物工程(大連)有限公司；ExTaq聚合酶，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Promega公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自天根生化科技(北京)有限公司；綠如藍(lán)核酸染料(UV型)，購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.4 病毒RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 參照TRIzol法使用說明書進(jìn)行病毒抽提，按照如下體系進(jìn)行配制：AMV 1.5 μL，5×AMV Buffer 10 μL，dNTPs 2 μL，PRI 1 μL，將上述14.5 μL體系與33.5 μL RNA和2 μL 6 nt引物充分混勻后，于42 ℃水浴2 h，75 ℃水浴5 min，將病毒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 全基因的擴(kuò)增與克隆

1.5.1 引物合成 參考GenBank公布的NDV全基因組序列(主要參考ZJ1、SF2等毒株的核苷酸序列)，共設(shè)計(jì)了11對(duì)引物，相鄰擴(kuò)增片段之間有100 bp 左右的重疊序列，引物覆蓋NDV的整個(gè)基因組。所設(shè)計(jì)的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成，引物序列見表1。

表1 NDV全基因組擴(kuò)增的PCR引物表

1.5.2 Pigeon/China/SHJD13/2017各基因的擴(kuò)增 采用50 μL的PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L上下游引物各2 μL，PCR Mix 25 μL，cDNA 2 μL，滅菌超純水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55～60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.5.3 Pigeon/China/SHJD13/2017全基因片段的克隆轉(zhuǎn)化 將上述PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，按照DNA凝膠回收試劑盒操作說明書純化回收瓊脂糖凝膠。按pMD19-T載體說明書加入連接體系，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定陽性者送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.6 測序結(jié)果的拼接和比較分析 利用DNASTAR、MEGA等軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)拼接分析，并繪制其進(jìn)化樹。

1.7 Pigeon/China/SHJD13/2017病毒MDT、EID50以及1日齡雛雞ICPI的測定 按照參考文獻(xiàn)[6]，測定Pigeon/China/SHJD13/2017分離株的雞胚半數(shù)感染量(EID50)、雞胚最小致死量平均死亡時(shí)間(Mean death time,MDT)，同時(shí)進(jìn)行1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(Intracerebral pathogenicity index in day-old chickens,ICPI)的測定。

2 結(jié)果

2.1 Pigeon/China/SHJD13/2017病毒的噬斑純化 病毒做10-5稀釋時(shí)可以產(chǎn)生明顯空斑，挑取純化后的噬斑加入800 μL維持液中，將其作為第2輪病毒純化的母液，再次接種DF-1細(xì)胞后進(jìn)行純化，采取相同的方法共純化3次。

2.2 病毒毒力測定 Pigeon/China/SHJD13/2017病毒毒力測定結(jié)果顯示，分離株EID50為10-8/mL、MDT為57.2 h(<60 h)、ICPI為2(>1.6)，其MDT和ICPI結(jié)果均符合NDV強(qiáng)毒株的毒力指標(biāo)。

2.3 全基因序列比較 用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，如圖1所示，結(jié)果所設(shè)計(jì)的11對(duì)引物均能擴(kuò)增出清晰的目的條帶，且條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 NDV Pigeon/China/SHJD13/2017分離株全基因RT-PCR結(jié)果

2.4 NDV Pigeon/China/SHJD13/2017分離株全基因組結(jié)果分析 測序后，用DNASTAR軟件進(jìn)行拼接，鑒于NDV末端序列高度保守的特性，本試驗(yàn)沒有進(jìn)行RACE試驗(yàn)測定病毒3′和5′基因組末端序列，其基因組全長15 192 bp。將分離株基因的核苷酸序列與其他NDV參考株相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。從進(jìn)化樹中可以看出，分離株與Chicken/China/SDWF07/2011、Chicken/China/Shandong/02/2012這2株雞源Ⅶ NDV同源性高達(dá)99.9%，與GenBank上已發(fā)表的鴿源Ⅶ NDV 毒株的同源性也均在99%以上。

圖2 40株NDV毒株全基因編碼核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹

分離株F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸殘基為112R-R-Q-K-R-F117，符合NDV強(qiáng)毒株的分子特征，參照Lomniczi B等[7]的分析方法，Pigeon/China/SHJD13/2017分離毒株F蛋白的101位氨基酸為K，121位氨基酸為V，是基因Ⅶ型NDV的分型特征。其F蛋白抗原決定簇、潛在糖基化位點(diǎn)以及13個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)均高度保守，與當(dāng)前分離出的鴿源Ⅶ毒株相比，其F基因僅在78位以及231位氨基酸位點(diǎn)處表現(xiàn)出了特異性，具體結(jié)果見表2。

表2 分離株F、HN蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)與鴿源VII、雞源VII毒株之間的比較

HN基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，分離株HN共編碼571 aa，符合NDV強(qiáng)毒的特征，該分離株含有13個(gè)半胱氨酸殘基，6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，且高度保守。與當(dāng)前分離出的鴿源Ⅶ毒株相比，其HN基因僅在36、49、102、120等位點(diǎn)上表現(xiàn)出一定的特異性。

3 討論

鴿新城疫是由新城疫病毒感染引起的臨床上以腹瀉和神經(jīng)癥狀為主的一種急性、敗血性、高度接觸性鴿類傳染病，其臨床表現(xiàn)與雞新城疫相似，對(duì)養(yǎng)鴿業(yè)危害嚴(yán)重[8]。其中，引發(fā)第三次大流行的鴿源新城疫病毒于20世紀(jì)60年代在德國被發(fā)現(xiàn)，死亡率達(dá)到50%[9]。20世紀(jì)70年代傳至中東地區(qū)，死亡率可達(dá)80%。1985年該病傳至我國香港，隨后鴿源新城疫病毒傳至我國各地，成為威脅我國養(yǎng)鴿業(yè)的一種主要疾病[10]。

在分子生物學(xué)大規(guī)模應(yīng)用前，NDV的分類主要采用單抗排譜法，Alexander D J等將鴿源NDV命名為P群[11]。隨后，Dorina等通過對(duì)68株NDV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，將鴿源NDV歸于Ⅵb亞型[12]。而Ⅵb亞型又分為Ⅵb1和Ⅵb2兩個(gè)分支，其中大部分毒株屬于Ⅵb1分支。劉秀梵等對(duì)我國1985-2011年的新城疫病毒進(jìn)行了基于F基因47～420位核苷酸的遺傳進(jìn)化分析及限制性酶切分析，將基因Ⅵ型NDV劃分為Ⅵa-Ⅵg七個(gè)亞型，其中鴿源毒株被歸為基因Ⅵb亞型，我國2000年后所報(bào)道的鴿源NDV分離株基本屬于這一分支[13]。

自20世紀(jì)90年代基因Ⅶ型NDV成為世界優(yōu)勢(shì)毒株以來，其宿主范圍有不斷擴(kuò)大趨勢(shì)。目前該型毒株在雞、火雞、鴨、鵝和觀賞禽類中均有分布[14]。但在鴿群中的分布報(bào)道依然比較少見。吳雙等用基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株感染鴿子后，發(fā)現(xiàn)其能造成攻毒鴿100%的死亡，而且感染鴿的發(fā)病程度與死亡率明顯高于傳統(tǒng)的Ⅵb亞型毒株[15]。黎俊君等從廣東分離的4株鴿源NDV有1株為Ⅶ型，2株為Ⅵ型，1株屬于Ⅱ型[15-16]。隨后何琴等也從鴿體內(nèi)分離到1株基因Ⅶ強(qiáng)毒株，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明該毒株與廣西鴿源株Gxp40處于同一系分支，同源性最近[17]。雖然目前基因Ⅶ型NDV毒株在鴿子體內(nèi)只是偶有分離，但鴿群感染Ⅶ型毒株并造成發(fā)病和流行的風(fēng)險(xiǎn)依然存在。

本試驗(yàn)分離出的NDV從生物學(xué)特性上來看，是1株鴿源基因Ⅶ型新城疫強(qiáng)毒，關(guān)于其對(duì)鴿的致病性，有待進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)確認(rèn)。通過全基因組測序，以及對(duì)分離株各基因的起始、終止位置和基因間隔位置進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其與Ⅶ 型毒株的序列基本相同。利用MEGA軟件繪制進(jìn)化樹確定其與雞源基因Ⅶ 型新城疫強(qiáng)毒親緣關(guān)系較近。對(duì)F基因進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，分離株與Chicken/China/SDWF07/2011、Chicken/China/Shandong/02/2012這2株雞源Ⅶ NDV同源性高達(dá)99.9%，與GenBank上已發(fā)表的鴿源Ⅶ NDV 毒株的同源性也均在99%以上。相關(guān)研究顯示，基因Ⅶ型NDV可以在鴿子和雞之間進(jìn)行相互傳播[15]，這揭示了該分離株可能來自于感染的雞群。此外，該分離株的MDT、EID50、ICPI測定結(jié)果也均符合NDV強(qiáng)毒株的分子特征。與當(dāng)前分離出的鴿源Ⅶ 毒株相比，F(xiàn)基因在78位以及231位氨基酸位點(diǎn)處表現(xiàn)出了特異性。而HN基因在36、49、102、120等位點(diǎn)處氨基酸殘基與部分雞源Ⅶ毒株編碼的氨基酸序列一致，這進(jìn)一步揭示了本試驗(yàn)的鴿源分離株可能來源于感染的雞群。相比較NDV的其他宿主，鴿活動(dòng)范圍較大，若攜帶強(qiáng)毒株NDV進(jìn)行擴(kuò)散，則有可能導(dǎo)致新一輪新城疫的大流行，因此，了解鴿源NDV的遺傳演化規(guī)律及其流行病學(xué)情況，對(duì)于新城疫的臨床診斷和防控具有重要的指導(dǎo)意義。