基于宏基因組學(xué)研究分析黑葉猴腸道微生物的多樣性

段春慧，王興金，李婉萍，李 超，蔣麗霞，李毅峰，余建國

(1.廣州動(dòng)物園，廣東 廣州 510070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；3.梧州市園林動(dòng)植物研究所 梧州市黑葉猴保護(hù)研究中心，廣西 梧州 543000)

哺乳動(dòng)物的消化系統(tǒng)中含有一個(gè)復(fù)雜的微生物群落，它們是宿主消化系統(tǒng)不可或缺的一部分[1-2]。近年來，高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，進(jìn)一步揭示了腸道微生物群在動(dòng)物健康和代謝中發(fā)揮的日益重要的作用[1,3-4]。因此，了解特定動(dòng)物類群中腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)，對(duì)研究動(dòng)物腸道微生物與宿主本身的協(xié)同進(jìn)化具有重要意義[5]。

靈長類動(dòng)物已經(jīng)進(jìn)化了數(shù)百萬年，適應(yīng)了各種各樣的棲息地和飲食[6]。黑葉猴(Trachypithecusfrancoisi)是世界上珍貴稀有靈長類動(dòng)物之一，屬于我國一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，主要分布于中國的廣西、貴州及重慶[7]，棲息于熱帶雨林、季雨林、亞熱帶常綠闊葉林及石山灌叢等地[7]。人工飼養(yǎng)條件下的黑葉猴可能受到氣候、飼養(yǎng)環(huán)境、食物結(jié)構(gòu)等的影響，其腸道菌群也隨之發(fā)生改變。

宏基因組學(xué)作為新興的分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛用于開展微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性以及其相互關(guān)系等相關(guān)研究[8]，可以更準(zhǔn)確地反映出微生物生存的真實(shí)狀態(tài)。因此，研究非人靈長類如黑葉猴腸道菌群，對(duì)理解宿主的食性適應(yīng)和監(jiān)測(cè)宿主的健康狀況有重要意義[1]。

本試驗(yàn)通過對(duì)黑葉猴糞便16S rRNA及宏基因組測(cè)序分析，初步了解黑葉猴腸道微生物的基本組成及主要微生物的種類，并對(duì)不同環(huán)境下其腸道微生物的豐度、組成及差異進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與來源 黑葉猴糞便：分別采集自展區(qū)18、展區(qū)19、飼養(yǎng)場(chǎng)和梧州組的黑葉猴的新鮮糞便，于-80 ℃保存后干冰運(yùn)輸，用于糞便微生物多樣性分析。采樣和分組見表1。

表1 采樣和分組情況

1.2 方法

1.2.1 黑葉猴糞便總DNA提取 利用糞便基因組DNA提取試劑盒提取各組黑葉猴糞便樣品中微生物基因組DNA。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。最終上機(jī)測(cè)序及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析由深圳華大基因股份有限公司完成。

1.2.2 16S rRNA的擴(kuò)增、測(cè)序與分析 取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng進(jìn)行PCR擴(kuò)增(16S rRNA的V3～V4區(qū))并進(jìn)行純化。檢測(cè)合格后利用HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與16S rRNA細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(silva119)比對(duì)進(jìn)行注釋，繼而進(jìn)行黑葉猴腸道微生物多樣性分析，并對(duì)4組黑葉猴的菌群變化進(jìn)行差異分析。

1.2.3 細(xì)菌宏基因組的擴(kuò)增、測(cè)序與分析 取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品，使用Covaris超聲儀將DNA片段化后獲得符合長度要求的短DNA片段。構(gòu)建文庫并通過聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(cPAS)進(jìn)行測(cè)序。從下機(jī)原始序列開始對(duì)原始序列進(jìn)行拆分、質(zhì)量剪切以及去除污染等優(yōu)化處理并使用優(yōu)化序列進(jìn)行拼接組裝和基因預(yù)測(cè)，對(duì)得到的基因進(jìn)行物種和功能上的注釋以及分類。

2 結(jié)果

2.1 Alpha多樣性分析 本試驗(yàn)通過Alpha多樣性(Alpha diversity)分析黑葉猴糞便樣品中的菌群豐度?；?6S rRNA測(cè)序通過Shannon指數(shù)進(jìn)行Alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)組中的群落多樣性(OUT水平)均較整齊(見中插彩版圖1 A)。同時(shí)結(jié)合宏基因組測(cè)序通過Shannon指數(shù)進(jìn)一步評(píng)估各組樣品菌群豐度，結(jié)果顯示，4個(gè)組中Shannon指數(shù)在門、科和屬水平均無明顯差異(見中插彩版圖1 B)。因此本試驗(yàn)基于16S rRNA和宏基因組測(cè)序結(jié)果均表明各組間微生物群落豐度無明顯差異。

2.2 黑葉猴腸道菌群物種與功能組成分析 有研究表明，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在所有非人靈長類腸道菌群中所占比例較高[1]。本試驗(yàn)中16S rRNA(結(jié)果未列出)和宏基因組結(jié)果均顯示：門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門在腸道微生物的組成中屬于優(yōu)勢(shì)群體，表明黑葉猴腸道菌群組成以及各菌門間的趨勢(shì)與多數(shù)哺乳動(dòng)物相似[9]。此外，在展區(qū)18和展區(qū)19這2組中Spirochaetes(螺旋體門)的占比也(類似16S rRNA結(jié)果)略高于另外兩組；Proteobacteria(變形菌門)在飼養(yǎng)場(chǎng)組的相對(duì)豐度高于梧州組、展區(qū)18和展區(qū)19三組(見中插彩版圖2 A)。

為進(jìn)一步探究不同飼養(yǎng)環(huán)境下黑葉猴腸道微生物多樣性，我們利用群落柱形圖分析不同樣本基于屬水平的優(yōu)勢(shì)物種及相對(duì)豐度。從結(jié)果分析來看，在4個(gè)組中除去未被注釋到的微生物(Unclassfied)，其中梭菌屬(Clostridium)、普 雷 沃 氏 菌 屬(Prevotella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、另枝菌屬(Alistipes)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、密螺旋體屬(Treponema)、顫桿菌屬(Oscillibacter)屬于4個(gè)組中的優(yōu)勢(shì)菌群(見中插彩版圖2 B)。而豐度略有不同的菌群如梭菌屬(Clostridium)在梧州組的相對(duì)豐度要高于其他三組；普雷沃氏菌屬(Prevotella)和擬桿菌屬(Bacteroides)在梧州組的相對(duì)豐度要低于其他三組；瘤胃球菌屬(Ruminococcus)在飼養(yǎng)場(chǎng)的相對(duì)豐度要高于其他三組。

此外，根據(jù)微生物種水平群落組成分析發(fā)現(xiàn)，在4個(gè)組中除去未被注釋到的微生物(Unclassfied)，其中Alistipes_sp._CAG:435 和Treponema_succinifaciens屬于4個(gè)組中的優(yōu)勢(shì)菌群。Alistipes_sp._CAG:435在飼養(yǎng)場(chǎng)和展區(qū)19中的相對(duì)豐度低于其他兩組；而Treponema_succinifaciens在展區(qū)19中的相對(duì)豐度高于其他三組(見中插彩版圖2 C)，這可能與展區(qū)19未進(jìn)行消毒，環(huán)境微生物較為豐富有關(guān)。

2.3 Beta多樣性分析 采用Beta多樣性具體評(píng)估微生物群落間的差異。通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，在OTU水平，除展區(qū)18和展區(qū)19有一些重疊，其他各組間菌群組成離散情況較明顯，存在較大差異(見中插彩版圖3 A)。而利用宏基因組測(cè)序進(jìn)行PCA分析發(fā)現(xiàn)，在物種水平梧州組和飼養(yǎng)場(chǎng)組群落構(gòu)成重疊較多，差異較小(見中插彩版圖3 D)；而梧州組和展區(qū)19的群落構(gòu)成相比其離散程度大于梧州組與展區(qū)18的群落構(gòu)成(見中插彩版圖3 B、3 C)。

2.4 黑葉猴腸道菌群物種與功能差異比較分析 根據(jù)16S rRNA測(cè)序結(jié)果分析,在屬水平中進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豐度在Top 15的群落中，有7個(gè)存在顯著性差異，分別是：Prevotella_9,Treponema_2,unclassified_f_Lachnospiraceae,[Eubacterium]_coprostanoligenes_group,unclassified_k_norank_d_Bacteria,Christensenellaceae_R-7_group,Ruminococcaceae_NK4A214_group(見中插彩版圖4 A)。利用宏基因組測(cè)序?qū)谌~猴腸道菌群差異性進(jìn)行分析。其中環(huán)境豐度最低的梧州組和飼養(yǎng)場(chǎng)2組樣本中豐度存在顯著性差異的屬主要為：Thermosinus、Thermophagus等(見中插彩版圖4 D)。梧州組和展區(qū)18這兩組樣本存在顯著性差異的屬主要為：Unclassfied、Tyzzerella、Tannerella等(見中插彩版圖4 C)。而梧州組和展區(qū)19兩組樣本存在顯著性差異的屬主要為：Tyzzerella、Tannerella、Ruminococcus等(見中插彩版圖4 B)，這與梧州組和展區(qū)18的比較結(jié)果較為相似，也間接說明展區(qū)18與展區(qū)19環(huán)境豐度較為相似。

2.5 黑葉猴腸道菌群功能基因分析

2.5.1 差異基因分析 基于宏基因組測(cè)序結(jié)果，對(duì)各組差異基因進(jìn)行比對(duì)分析，并以火山圖表現(xiàn)(見中插彩版圖5)。梧州組和另外3個(gè)組比較，其差異基因均比較多，在4 000個(gè)以上，并且差異基因中的大部分基因豐度低于其他組，這可能與其環(huán)境豐度較低有關(guān)。本試驗(yàn)中環(huán)境豐度從高到低依次為：展區(qū)19、展區(qū)18、飼養(yǎng)場(chǎng)、梧州組，而結(jié)果顯示某些差異基因的豐度也呈現(xiàn)類似的規(guī)律性。

2.5.2 黑葉猴腸道菌群差異基因KEGG功能分析 基于16S rRNA測(cè)序結(jié)果，分別進(jìn)行COG和KEGG功能注釋，獲得OTU在COG、KEGG各功能水平的注釋信息及各功能在不同樣本中的豐度信息。結(jié)果顯示，所有樣本的COG功能組成較為相似，在不同飼養(yǎng)區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)較大變化(結(jié)果未列出)。對(duì)KEGG代謝通路Level 1水平豐度統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)Environmental information processing，Genetic information processing和Metabolism這3個(gè)通路的基因豐度最高。因此結(jié)合宏基因組測(cè)序結(jié)果對(duì)KEGG注釋結(jié)果進(jìn)行分析。宏基因組結(jié)果表明，4組在Level 1分類中，Metabolism所含的基因數(shù)目最多，其中含基因數(shù)目較多的Level 2分類有Global and overview maps，Carbohydrate metabolism和Amino acid metabolism。而Environmental Information Processing中僅有3個(gè)Level 2分類水平，其中Membrane transport和Signal transduction的數(shù)量最多(見中插彩版圖6 A)。

結(jié)合宏基因組數(shù)據(jù)將環(huán)境豐度相對(duì)較低的梧州組與其他三組差異基因利用KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)而得的功能注釋進(jìn)行分析(數(shù)據(jù)庫內(nèi)無功能注釋的不含在內(nèi))。梧州組與其他三組比較，在Level 1分類中，Metabolism所含的基因數(shù)目均顯示最多，其次是Genetic information processing；含基因數(shù)目較多的Level 2分類均含有Global and overview maps、Replication and repair和Membrane transport(見中插彩版圖6 B、6 C、6 D)。此外梧州組和展區(qū)18組的差異基因整體較多；但Level 1分類水平最少的是Organismal system(見中插彩版圖6 C)，而在其他2組比較中最少的是Human diseasess(見中插彩版圖6 B、6 D)。

3 討論

腸道微生物與宿主的健康密切相關(guān)，而作為和人類親緣關(guān)系最近的靈長類動(dòng)物，其腸道微生物研究具有重要意義[10]。近年來，隨著16S rRNA和宏基因組測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，腸道微生物群研究目前已成為現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域熱點(diǎn)[8]。本試驗(yàn)綜合16S rRNA 及宏基因組測(cè)序分析了不同飼養(yǎng)環(huán)境下黑葉猴腸道微生物群落組成及豐度變化，并對(duì)其差異基因功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

本試驗(yàn)中黑葉猴腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群是在纖維物質(zhì)消化中起主要作用的厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，這與黑葉猴采食樹葉等食性相關(guān)[1,7]，且與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而基于屬水平所鑒定出的優(yōu)勢(shì)菌群梭菌屬(Clostridium)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)等可幫助黑葉猴分解樹葉中的纖維素及降解樹葉中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物，表明腸道菌群在黑葉猴的營養(yǎng)消化吸收方面起到重要作用[11-13]。

有研究表明，圈養(yǎng)和野生大熊貓群落微生物存在一定差異，這與其棲息環(huán)境、食物資源、活動(dòng)節(jié)律等的影響密切相關(guān)[14]。本試驗(yàn)綜合差異基因比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梧州組與另外三組比較，其差異基因均較多，且差異基因中的大部分基因豐度均低于其他組。推測(cè)與本試驗(yàn)中環(huán)境豐度從高到低依次為：展區(qū)19、展區(qū)18、飼養(yǎng)場(chǎng)、梧州組?；谖锓N與功能差異比較分析發(fā)現(xiàn)，梧州組與展區(qū)19以及梧州組與展區(qū)18的比較結(jié)果較為相似，這也間接說明展區(qū)18與展區(qū)19環(huán)境豐度較為相似，也可能與展區(qū)19 的環(huán)境是在展區(qū)18的基礎(chǔ)上進(jìn)行改變有關(guān)(在展區(qū)18中增加墊料且不進(jìn)行常規(guī)消毒成為展區(qū)19)。而綜合環(huán)境豐度與PCA比較分析發(fā)現(xiàn)，梧州組和另外三組腸道菌群相比的離散程度隨環(huán)境豐度的增加而增加，提示微生物群落構(gòu)成與飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)(混凝土地面加上消毒殺滅環(huán)境微生物)。

瘤胃球菌屬(Ruminococcus)等菌群與動(dòng)物的食性和代謝存在一定的關(guān)系[5]。本試驗(yàn)中瘤胃球菌屬(Ruminococcus)在四組黑葉猴腸道中屬于優(yōu)勢(shì)菌群中的一種，而且在四組中存在一定差異。而腸道菌群差異基因功能分析結(jié)果顯示，4個(gè)組中與代謝相關(guān)的基因數(shù)目最多，這與靈長類動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境溫度、食物種類及其攝取營養(yǎng)有關(guān)。也因此說明了動(dòng)物進(jìn)化過程中，腸道微生物組成結(jié)構(gòu)與動(dòng)物食性和生活環(huán)境密切相關(guān)。

近年來，我國已出現(xiàn)一些有關(guān)非人靈長類動(dòng)物腸道菌群的研究，但總的來說研究現(xiàn)狀還相對(duì)滯后[1]。本試驗(yàn)通過16S rRNA和宏基因組測(cè)序?qū)Σ煌h(huán)境下黑葉猴腸道微生物進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)其腸道菌群與環(huán)境豐度存在密切聯(lián)系，對(duì)于了解靈長類動(dòng)物腸道微生物群的組成及其功能具有重要意義。然而雖然通過宏基因組對(duì)功能基因進(jìn)行了分析比較，但具體的影響機(jī)制還不明確，有待進(jìn)一步研究。