3.0T動態(tài)增強MRI定量灌注直方圖參數(shù)與肺癌AKT/mTOR信號通路的相關性

張冰倩，趙振華*，黃亞男，毛海佳，鄒明月，王誠，喻光懋，張敏鳴

1.浙江大學醫(yī)學院紹興醫(yī)院（紹興市人民醫(yī)院）放射科，浙江紹興 312000；2.浙江大學醫(yī)學院紹興醫(yī)院（紹興市人民醫(yī)院）病理科，浙江紹興 312000；3.浙江大學醫(yī)學院紹興醫(yī)院（紹興市人民醫(yī)院）心胸外科，浙江紹興 312000；4.浙江大學附屬第二醫(yī)院放射科，浙江杭州 310009； *通訊作者 趙振華 zhao2075@163.com

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康和生命[1-2]。近年來，肺癌的治療已經(jīng)從放化療發(fā)展到基于分子基因、靶向免疫等的個性化治療。蛋白激酶B（proteinkinase B，AKT）/磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細胞內一條重要的信號轉導通路，磷酸化AKT（p-AKT）是AKT 的活化狀態(tài)，參與調控細胞的生存、增殖和分化等功能[3]。mTOR 是p-AKT 的直接下游信號分子，參與調節(jié)細胞的生長發(fā)育、遷移侵襲。在腫瘤進展中p-AKT、mTOR 表達異常升高[4-5]。AKT、mTOR 作為新的免疫治療靶點，相關的靶向藥物（如MK-2206、雷帕霉素等）越來越有希望運用于肺癌的治療[6]。目前，檢測p-AKT、mTOR的方法主要依靠對腫瘤組織侵入性的穿刺取樣，由于組織標本僅能反映局部的組織情況而不能反映整個腫瘤組織情況，尤其腫瘤較大時，往往生長不均質，局部標本容易產生誤差。本研究擬通過動態(tài)增強MRI（DCE-MRI）定量灌注直方圖參數(shù)與肺癌組織p-AKT、mTOR 表達的相關性，探討對病灶的分子病理信息進行無創(chuàng)性、可重復性預測的可行性，為臨床選擇治療方案提供重要信息。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性收集紹興市人民醫(yī)院2017年1月—2018年4月經(jīng)肺部活檢穿刺或術后病理證實的肺癌33例，年齡50～85歲，平均（67±9）歲，其中鱗癌15例，腺癌12例，小細胞肺癌6例。納入標準：①肺部病灶直徑>2 cm；②MRI 檢查前未接受穿刺、手術、放化療、藥物治療等；③手術或穿刺活檢后經(jīng)病理確診為肺癌；排除標準：①手術或穿刺與MRI 檢查間隔3個月以上；②圖像掃描質量不佳或腫塊邊界不明確。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（批準號202063）。

1.2 MRI 檢查 采用Siemens Verio 3.0T MRI 掃描儀，體部表面相控陣線圈掃描。先行常規(guī)平掃，于動態(tài)增強掃描前進行多翻轉角掃描，掃描參數(shù)：TE 1.17 ms，TR 3.25 ms，翻轉角5°、10°、15°，矩陣162×288，視野350 mm×282 mm，層厚5 mm，層數(shù)30，每期時間分辨率為6.5 s。動態(tài)增強掃描：翻轉角10°，掃描35個時相，其余參數(shù)同上。DCE 掃描至第3 時相時經(jīng)肘正中靜脈高壓注射釓雙胺對比劑（歐乃影），劑量0.1 mmol/kg，速度3 ml/s，然后用20 ml 生理鹽水以相同速度沖管。將翻轉角與DCE 掃描序列導入Omni.Kinetics 軟件，使用3D 非剛性校正技術對呼吸運動偽影進行校正（圖1）。

圖1 3D 非剛性校正技術對肺癌患者DCE-MRI 掃描圖像呼吸運動偽影進行校正。配準前的肺動脈時間-濃度曲線（綠線）與胸主動脈時間-濃度曲線（藍線）擬合較差（A）；配準后，肺動脈與胸主動脈期相-濃度曲線擬合改善，曲線更光滑（B）

1.3 圖像后處理 選用肺動脈與支氣管動脈雙血供動脈輸入函數(shù)類型進行圖像后處理，并測量數(shù)據(jù)。選擇腫瘤最大層面上下3～5個層面勾畫病灶感興趣區(qū)（ROI），避開囊變、壞死、周圍血管區(qū)以及正常肺組織，整合成1個3D ROI 進行定量分析。最終獲得轉移常數(shù)（Ktrans）、血漿容積分數(shù)（Vp）、速率常數(shù)（Kep）、血管外細胞外間隙容積分數(shù)（Ve）的直方圖參數(shù)（均值、偏度、峰度、均一性、能量、熵、百分位數(shù)）。由2名高年資放射科醫(yī)師進行數(shù)據(jù)處理，測量3 次并取平均值。

1.4 p-AKT、mTOR 蛋白表達檢測及結果判定 手術切除或穿刺活檢標本常規(guī)石蠟包埋、切片、脫水，采用免疫組化分數(shù)測定染色結果[7]。免疫組化分數(shù)=染色強度分級×染色細胞百分數(shù)。染色細胞百分數(shù)：無染色計0分，染色細胞 ≤10%計1分， 11%～50%計2分， 51%～80%計3分，染色細胞 ≥81%計4分；染色強度：無染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3 分。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 軟件，分類變量比較采用Fisher 確切概率法。使用Shapiro-Wilk 檢驗對計量資料進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；非正態(tài)分布的計量資料用M（Q1，Q3）表示，多組間比較采用Kruskal-Walls 檢驗，多組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。用Spearman 檢驗分析p-AKT、mTOR 表達與各DCE-MRI定量灌注直方圖參數(shù)之間的相關性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 不同病理亞型肺癌患者性別、年齡、體重指數(shù)及腫瘤最大徑組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 33例不同病理亞型肺癌患者一般資料比較

2.2 不同病理亞型肺癌灌注直方圖參數(shù)比較及p-AKT、mTOR 表達的差異 各灌注參數(shù)Ktrans、Kep、Ve、Vp直方圖參數(shù)在不同病理亞型組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。p-AKT、mTOR 在3 組不同病理亞型肺癌中表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003，P=0.037）。腺癌中p-AKT、mTOR 表達顯著高于鱗癌（P=0.014、P=0.001）（圖2、3）。

圖2 男，82歲，左上肺鱗癌。A 為肺癌病灶組織的p-AKT免疫組化染色圖，免疫組化分數(shù)為1 分（×400）；B 為肺癌病灶組織的mTOR 免疫組化染色圖，免疫組化分數(shù)為2 分（×400）

圖3 不同病理亞型肺癌組織p-AKT 及mTOR 表達

2.3 不同病理亞型肺癌定量灌注直方圖參數(shù)與p-AKT、mTOR 的相關性 Spearman 檢驗結果顯示，小細胞癌組Kep（Q5、Q10）與p-AKT表達呈正相關（ρ=0.841，P=0.036），Kep（能量）與p-AKT表達呈負相關（ρ=-0.841，P=0.036）；鱗癌組Ktrans（Q5）（ρ=0.760，P=0.001）和小細胞癌組Vp（均值、Q75、Q90、Q95）（ρ=0.926，P=0.008）與mTOR 呈正相關；鱗癌組Ve（均值）與mTOR 呈負相關（ρ=-0.619，P=0.014）（圖4、5）。

圖4 女，63歲，病理診斷為右上肺小細胞癌。A.病灶Ktrans偽彩圖；B.病灶Vp 偽彩圖；C.Vp 直方圖（均值=0.126、偏度=1.302、峰度=2.419、均一性=0.462、能量=0.009、熵=7.042）；D.Ktrans 直方圖（均值=0.175、偏度=0.956、峰度=1.358、均一性=0.521、能量=0.008、熵=7.164）

圖5 肺癌p-AKT、mTOR 與EC 模型灌注直方圖參數(shù)Kep 能量及Ve 均值的相關性

3 討論

目前肺癌的治療方法仍以放化療及手術為主。隨著對肺癌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR 通路是肺癌治療中的重要靶點之一[8]。既往研究表明，AKT/mTOR 靶向藥物與臨床化療藥物聯(lián)用比單獨用藥能更有效地抑制腫瘤活性，延長肺癌患者的生存時間[9-11]。與穿刺等侵入性檢查相比，DCE-MRI 是一項無創(chuàng)、可重復的檢查方法，所得灌注參數(shù)Ktrans、Kep、Vp、Ve能反映腫瘤的血流灌注和血管通透性等微環(huán)境的改變[12]，有助于了解腫瘤分化及惡性程度。直方圖分析用均值、偏度、峰度、能量、熵和百分位數(shù)較好地量化了腫瘤組織微循環(huán)狀態(tài)，反映腫瘤內部異質性[13]。

本研究中，不同病理亞型肺癌中AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達存在差異，腺癌組mTOR 與p-AKT表達顯著高于鱗癌，可能提示不同病理類型肺癌發(fā)展過程中AKT/mTOR信號通路激活不一致。Fumarola 等[14]研究發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR信號通路異常激活在肺鱗癌中比在肺腺癌中更常見。然而，Oh 等[15]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中p-AKT和mTOR 的表達較肺鱗癌更為頻繁，與本研究結果一致。導致不同研究結果差異的原因可能與缺乏普遍接受的標準通過免疫組化評估這些蛋白的表達有關。

AKT/mTOR信號通路激活可抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，還可以通過上調缺氧誘導因子、一氧化氮、COX-2 的表達促進腫瘤血管形成[16]。Kep是對比劑從血管外細胞外間隙回流到血管內的通過率，與血管壁通透性密切相關。本研究中鱗癌組Kep（Q5）、小細胞癌組Kep（Q5、Q10）隨著活化的p-AKT和mTOR 增多而增大，提示此信號通路的激活促進新生血管形成，血管壁滲透性增加。然而Kep均值與p-AKT、mTOR 無明顯相關，其可能原因是肺癌在發(fā)展過程中血供的復雜性及其生長不均勻性較正常組織高，使得百分位數(shù)等反映參數(shù)分布特征的變量較反映參數(shù)集中趨勢的平均值更有助于反映腫瘤的異質性[17]。能量與熵值體現(xiàn)像素分布的均勻性，能量越小，熵值越大，圖像亮度信息分布越不均勻[18]。小細胞癌組Kep（能量）與p-AKT 呈負相關，提示p-AKT表達增加促進腫瘤細胞增殖，腫瘤內部異質性增高，表現(xiàn)為Kep（能量）減小。

Vp可反映組織的血流灌注量，小細胞癌組Vp（均值、Q75、Q90、Q95）與mTOR 呈正相關，提示此信號通路下游信號分子的激活刺激了腫瘤的增殖與血管形成。以Vp（Q75、Q90、Q95）為代表的高百分位數(shù)與mTOR 呈正相關，而低百分位數(shù)無明顯相關，可能原因是小細胞癌增殖速度快，易多發(fā)小片壞死，未壞死部分血供豐富，Vp值較大。Ve與血管外細胞外間隙大小有關。本研究發(fā)現(xiàn)，鱗癌組Ve（均值）與mTOR呈負相關，激活的mTOR 越多，腫瘤增殖越活躍，血管外細胞外間質空間愈發(fā)減小，則Ve值越小。

本研究的局限性：①樣本量較小，特別是小細胞癌，有待今后擴大樣本量和細化研究方案；②僅勾畫了部分腫瘤最大層面作為ROI，可能在描述腫瘤空間異質性方面存在一些偏倚；③肺部進行DCEMRI 掃描呼吸運動偽影較為常見。然而，本研究使用三維非剛性校正技術減少運動偽影對研究的影響。

總之，DCE-MRI定量灌注參數(shù)直方圖參數(shù)Kep（Q5、Q10、能量）、Ktrans（Q5）、Vp（均值、Q75、Q90、Q95）和Ve（均值）與肺癌p-AKT、mTOR 蛋白表達具有相關性，能間接評價肺癌組織AKT/mTOR信號通路基因激活狀態(tài)，具有無創(chuàng)、客觀、可量化、可重復性好的優(yōu)勢，對肺癌的診斷和AKT/mTOR 靶向藥物的選擇等有一定的指導意義。