大黃素對(duì)黑素瘤B16F10細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響

袁銘杰 劉天一 陳 亮 王萬晨 劉 馳 畢 波

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院整形美容外科，上海，200040

惡性黑素瘤(malignant melanoma, MM)是一種來源于黑素細(xì)胞的腫瘤，其惡性程度高，預(yù)后差。目前MM的發(fā)病率約以每年3%～5%的速度增長，近年來，其死亡率也存在逐漸升高的趨勢(shì)[1]。目前國內(nèi)針對(duì)晚期惡性黑素瘤患者，臨床常用的治療手段仍以姑息手術(shù)、化療和放療為主，但治療效果并不理想[2]。因此，有待發(fā)現(xiàn)新的黑素瘤治療方法。大黃素(emodin)是一種提取自大黃、虎杖、何首烏等多種中藥材根莖中的天然蒽醌類衍生物，許多研究表明，大黃素具有抗炎、抑菌及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[3-5]。且隨著對(duì)大黃素抗腫瘤活性研究的進(jìn)一步深入，研究人員發(fā)現(xiàn)大黃素可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)其凋亡等方式對(duì)肺癌，乳腺癌等腫瘤起抑制作用[6,7]。本研究主要觀察大黃素對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10增殖，遷移及凋亡情況的影響，為大黃素治療黑素瘤的臨床應(yīng)用上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；大黃素、二甲亞砜(DMSO)購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，CCK-8試劑盒，0.25% EDTA-胰酶購自美國Gibco公司；TUNEL試劑盒，PI染液，DAPI染色試劑盒購自南京凱基生物有限公司；青霉素、鏈霉素溶液購自Amresco公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿和96 孔細(xì)胞培養(yǎng)皿購自美國Costar公司。caspase-3抗體購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 大黃素用DMSO溶解成0.2 mmol/L母液，放置-20℃冰箱保存，使用時(shí)用DEME培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，DMSO在大黃素溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好B16F10細(xì)胞，用加入10%的胎牛血清，青霉素(終濃度100 U/L)及鏈霉素(終濃度100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)液(pH=7.4)，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，PBS清洗兩遍，加入0.25%的胰酶室溫消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，重懸細(xì)胞后，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取1×104/孔密度接種于96孔板中，對(duì)照組加入0.1% DMSO溶液，實(shí)驗(yàn)組加入10、20、40、60、80 μmol/L大黃素處理24 h及48 h，加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)吸光值，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞只加入等量的 PBS)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 倒置顯微鏡下觀察 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化離心后，將細(xì)胞按1×105/孔密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，對(duì)照組加入0.1% DMSO溶液，實(shí)驗(yàn)組加入60 μmol/L大黃素培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至100%時(shí)，在6孔板底部用marker筆畫3條平行的直線，用100 μL槍頭在6孔板中垂直均勻慢速的劃線，PBS洗凈劃線掉落的細(xì)胞，加入不同濃度大黃素?zé)o血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，并于24 h倒置熒光顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，拍照儲(chǔ)存，使用imageJ計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，并在無血清培養(yǎng)基中加入20、40、60 μmol/L大黃素溶液處理細(xì)胞，取150 μL密度為2×105/mL的處理細(xì)胞添加到上室,對(duì)照組加入0.1%DMSO溶液。下層24孔板中加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基800 μL，將24孔板放置在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后吸干上室液體，用棉簽小心擦去上室底部膜表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定Transwell小孔的底面，并用結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析各組之間的差異。

1.2.7 檢測(cè)細(xì)胞周期 用胰酶消化并收集經(jīng)20、40、60 μmol/L大黃素溶液處理24 h后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入70%乙醇在4℃下固定4 h，再次使用PBS溶液洗滌2次后加入500 μL PBS(50 μg/mL溴化乙錠，100 μg/mL RNase A, 0.2%Triton X-100)于4℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。

1.2.8 TUNEL法檢測(cè)B16F10細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞爬片消毒，去離子水多次沖洗并高壓滅菌，烘干后備用。將B16F10細(xì)胞按2×105/孔密度種入24孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜；待細(xì)胞貼壁后，加入大黃素(60 μmol/L)，繼續(xù)孵育24 h。將自然晾干的細(xì)胞爬片，采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次,每次5 min。按凱基試劑盒說明書配制TUNEL反應(yīng)液，整個(gè)過程冰上操作。滴加反應(yīng)液于每張細(xì)胞爬片，使反應(yīng)液完全覆蓋細(xì)胞區(qū)域。37℃避光反應(yīng)1 h，PBS洗3次,每次5 min。將DAPI液稀釋為1 mg/L后滴加于細(xì)胞爬片，37℃避光反應(yīng)15 min，PBS洗3次,每次5 min。滴加防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，避開周邊區(qū)域，隨機(jī)選取3個(gè)視野并計(jì)數(shù)，激光共聚焦顯微鏡下拍照儲(chǔ)存。

1.2.9 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 當(dāng)以20、40和60 μmol/L大黃素處理細(xì)胞24 h后，收集蛋白質(zhì)并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將分離的蛋白質(zhì)在90 V和200 mA的條件下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液封閉1 h。將PVDF膜在抗體稀釋溶液(兔抗小鼠caspase-3和β-actin；1∶3000)中于4℃孵育過夜。然后將印跡與二抗(1∶3000)4℃避光孵育1 h，再用PBST洗膜后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次后，計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度大黃素(10、20、40、60、80 μmol/L)作用B16F10細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為(90.1±1.4)%、(84.1±2.3)%、(76.6±3.7)%、(71.6±1.2)%、(56.8±2.8)%，作用48 h后，細(xì)胞存活率分別為(86.1±2.7)%、(75.5±2.1)%、(63.0±4.4)%、(54.3±5.3)%、(44.8±2.7)%，表明大黃素對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的抑制作用具有時(shí)間依賴性。與對(duì)照組相比，不同濃度大黃素組均存在顯著性差異(P<0.05)(圖1)，且隨著大黃素濃度的提升，細(xì)胞活性也隨之降低，表明大黃素呈濃度依賴性的抑制B16F10細(xì)胞增殖。24 h測(cè)得IC50為131.9 μmol/L，48 h測(cè)得IC50為68.1 μmol/L。

2.2 細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目改變 使用60 μmol/L大黃素處理B16F10細(xì)胞24 h后，對(duì)照組細(xì)胞生長狀況良好，顯微鏡下觀察呈貼壁形態(tài)不一的梭型，而大黃素組中細(xì)胞數(shù)目逐漸減少且細(xì)胞形態(tài)拉長呈現(xiàn)網(wǎng)狀樹突樣結(jié)構(gòu)。部分細(xì)胞在高濃度大黃素處理后，細(xì)胞體積縮小，固縮呈圓形(圖 2)。

2.3 大黃素對(duì)B16F10細(xì)胞遷移的影響 使用梯度濃度的大黃素(20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)分別處理B16F10細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合面積較對(duì)照組明顯減小(圖3a)，且隨著濃度的增加，大黃素對(duì)B16F10細(xì)胞遷移的抑制作用更加明顯，細(xì)胞橫向遷移率分別為(77.4±2.1)%、(57.2±3.7)%、(40.9±3.3)%、(7.9±1.7)%(圖4a)。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，用相同梯度濃度的大黃素溶液處理B16F10細(xì)胞24 h，顯微鏡下可見遷移至Transwell膜底面的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均明顯減少，并呈濃度依賴性改變(圖3b)，實(shí)驗(yàn)組遷移至膜底面的細(xì)胞數(shù)分別為(400.2±10.3)、(276.3±6.6)、(163.3±8.7)、(87.7±6.1)個(gè)，較對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖4b)。

圖1 不同濃度大黃素對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的影響 注：*與對(duì)照組比較,P<0.05 圖2 大黃素處理24 h后細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的變化(倒置顯微鏡，×100)

2.4 大黃素對(duì)細(xì)胞周期的影響 在對(duì)照組中大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期和S期，少數(shù)細(xì)胞處于G2/M期，隨著藥物濃度的上升，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目開始逐漸下降。與對(duì)照組相比，大黃素組S期細(xì)胞數(shù)目減少，而G2/M期細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)升高(圖5)。

2.5 大黃素對(duì)B16F10細(xì)胞凋亡的影響 使用大黃素溶液處理黑素瘤細(xì)胞24 h后，細(xì)胞經(jīng)染色后置于熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮和核碎片的細(xì)胞被判定為凋亡細(xì)胞。對(duì)照組DAPI染色后細(xì)胞核大多規(guī)則，呈圓形淺藍(lán)色，TUNEL著色細(xì)胞少；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)較對(duì)照組明顯增加，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核濃縮，或碎裂呈不規(guī)則形態(tài)，并出現(xiàn)點(diǎn)狀細(xì)胞核碎片(圖6)。

4a:20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L大黃素處理24 h后，各組劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移率；4b:20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L大黃素處理24 h后，Transwell實(shí)驗(yàn)中各組遷移至膜底面的細(xì)胞個(gè)數(shù)。*與對(duì)照組比較,P<0.05

5a：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度大黃素作用后的細(xì)胞周期分布；5b：不同濃度大黃素作用后細(xì)胞周期分布的定量分析，*與對(duì)照組比較,P<0.05

注：對(duì)照組B16F10細(xì)胞凋亡數(shù)目較少；大黃素組B16F10細(xì)胞凋亡數(shù)目增多

2.6 大黃素對(duì)細(xì)胞caspase-3蛋白水平表達(dá)的影響 caspase-3作為凋亡的執(zhí)行分子對(duì)細(xì)胞凋亡有重要影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，這些結(jié)果表明不同濃度大黃素(40 μmol/L、60 μmol/L)處理的細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)水平增加。 這些結(jié)果證實(shí)大黃素可能通過線粒體途徑促進(jìn)B16F10細(xì)胞凋亡。

注：不同濃度大黃素(40 μmol/L、60 μmol/L)處理的細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)水平增加

3 討論

黑素瘤增殖及侵襲能力強(qiáng)是導(dǎo)致其早期出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要因素，且黑素瘤化療效果差使得晚期黑素瘤患者5年生存率很低[8]。雖然這兩年來個(gè)體化的靶向治療和免疫治療在晚期黑素瘤中取得了一定進(jìn)展[9,10]，但缺乏中國患者應(yīng)用免疫及靶向藥物的相關(guān)數(shù)據(jù)。近來多項(xiàng)研究表明，大黃素可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長，且大黃素毒性小，不良反應(yīng)少，能和多種抗腫瘤藥物協(xié)同作用，并能降低其腫瘤耐藥性[11-15]。大黃素在16 μg/mL濃度下才對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)產(chǎn)生明顯增殖抑制作用[16]。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是藥物實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用的一項(xiàng)重要機(jī)制。有研究顯示,大黃素可經(jīng)線粒體途徑上調(diào)caspase-9，3分子表達(dá)，從而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。同時(shí)可通過細(xì)胞外途徑上調(diào)Fas及FasL等分子表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。線粒體凋亡途徑是實(shí)現(xiàn)大黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要抗腫瘤方式[18]，大黃素作用于細(xì)胞后可導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，引起caspase-9變構(gòu)活化,活化的caspase-9分子進(jìn)而激活下游caspase-3等凋亡效應(yīng)分子，最終引起細(xì)胞凋亡。大黃素在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)可伴有細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)的失活,并能促進(jìn)活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生[19]。Fang等[20]研究發(fā)現(xiàn)大黃素可通過下調(diào)CD155的表達(dá)從而抑制腫瘤增殖并將細(xì)胞阻滯于G2/M期。近期一項(xiàng)大黃素作用于黑素瘤的研究顯示[16]，大黃素可以充當(dāng)線粒體解偶聯(lián)劑，干擾線粒體氧化磷酸化，促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，降低了腫瘤細(xì)胞ATP的合成，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞糖酵解及能量代謝，從而抑制腫瘤增殖。大黃素還可通過降低MMP2和MMP9等分子的表達(dá)，減少對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，抑制腫瘤微血管的形成進(jìn)而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。其他研究表明，各類惡性黑素瘤均具有黑色素合成能力，大黃素作為一種天然蒽醌類衍生物，可抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的形成[22]，大黃素抗腫瘤能力也可能與其抗黑色素形成相關(guān)[23]。

本研究中，我們首先通過CCK8實(shí)驗(yàn)觀察大黃素對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)大黃素呈濃度及時(shí)間依賴性抑制B16F10細(xì)胞的增殖，并將細(xì)胞阻滯于G2/M期。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示大黃素能有效降低B16F10細(xì)胞的遷移能力，且具有劑量依賴性。大黃素干預(yù)后引起細(xì)胞的熒光染色及細(xì)胞形態(tài)的改變，且上調(diào)了凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)，表明大黃素的干預(yù)可導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡變化。結(jié)合文獻(xiàn)，可以推斷B16F10細(xì)胞的變化可能與大黃素作用后腫瘤細(xì)胞線粒體改變有關(guān)，是大黃素抑制黑素瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡的主要機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)在不同作用條件下觀察了大黃素對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大黃素可有效抑制B16F10細(xì)胞增殖、遷移能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但大黃素在如何調(diào)控及促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面還有待于更深一層的研究。