細(xì)麗外擔(dān)菌侵染對油茶葉生理生化變化的影響

闕生全，劉 鵬，王小東，喻愛林，涂業(yè)茍，張壹萱，肖相元

（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013）

油茶Camellia oleifera為世界四大木本油料植物之一，是我國特有的油料樹種[1]。該物種分布于中國南方低山丘陵地區(qū)[1]，主要分布于長江流域及其以南的江西、湖南、廣西等14 個?。ㄊ?、區(qū)），其中江西、湖南、廣西占全國油茶林總面積的76.2%[2]，在越南、泰國、馬來西亞和日本等也有少量分布[3]。茶油是一種品質(zhì)優(yōu)良穩(wěn)定的食用油[4]。近年來，食用油安全越來越被民眾所重視，并上升到國家戰(zhàn)略的高度[5]，茶油不斷受到我國各級政府的高度重視，并且出臺了《全國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009—2020）》，得到大力推廣，油茶種植面積迅速增加，極大地促進(jìn)了中國油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度。油茶餅病又稱油茶葉腫病，主要為害葉芽、花芽、子房和幼果，致使發(fā)病器官產(chǎn)生腫大變形，使油茶喪失結(jié)實和光合作用的功能[6]，制約油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。研究顯示，該病的致病菌為擔(dān)子菌綱細(xì)麗外擔(dān)菌目的細(xì)麗外擔(dān)菌Exobasidium gracile，該病發(fā)生在每年清明節(jié)前后，是影響油茶生產(chǎn)的主要病害之一[6-7]。

目前，學(xué)者已對油茶葉腫病的基本癥狀[6-10]、發(fā)病規(guī)律[7-10]、侵染循環(huán)[8-9]、腫病葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)[11]進(jìn)行了較多的研究，對病原菌的了解也較為深入[6-10]。而關(guān)于油茶茶餅病病理學(xué)的研究未見報道，對于細(xì)麗外擔(dān)菌對寄主的生理影響機制并不清楚。研究表明，病害脅迫屬典型的生物脅迫，可引發(fā)寄主植物基因的表達(dá)、代謝、光合速率和產(chǎn)量變化等一系列生理生化反應(yīng)[12-14]。如王雪等[15]研究顯示，棉花Gossypiumspp.葉片受棉花黃萎病菌Verticillium dahliae脅迫后，其葉片蛋白質(zhì)組發(fā)生明顯的變化；梁芳芳[16]研究表明，黃瓜Cucumis sativus葉片受霜霉病菌Pseudoperonosppora cuhensis脅迫后，其葉片有過敏性的反應(yīng)；崔宏偉等[17]研究認(rèn)為煙草Nicotiana tabacum葉片接種煙野火病菌Pseudomonas syringaepv.tahacci后，其葉片蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生明顯差異。Pins 等[18]和Gilati 等[19]發(fā)現(xiàn)壞損細(xì)麗外擔(dān)菌侵染茶葉后，糖類物質(zhì)等成份發(fā)生變化；單治國等[12]研究茶樹游離氨基酸受茶餅?。▔膿p細(xì)麗外擔(dān)菌）侵染后的種類和含量存在差異。

因此，為探討油茶茶餅病與某些生理生化指標(biāo)的響應(yīng)關(guān)系，以受侵染油茶葉為研究材料，通過檢測細(xì)麗外擔(dān)菌侵染油茶葉片后生理生化指標(biāo)的變化，探討侵染程度與生理生化反應(yīng)的相關(guān)性，為深入研究油茶與細(xì)麗外擔(dān)菌的互作機理提供理論基礎(chǔ)，以期為研究油茶葉腫病的病理學(xué)、細(xì)麗外擔(dān)菌的致病機理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料于2016年4月5日采集自江西省南昌市安義縣萬埠鎮(zhèn)龍源油茶示范基地（28°52′02.32″N，115°40′24.76″E），該基地面積2.05 hm2。以健康葉為對照，用枝剪剪取油茶（8年生油茶）被侵染后的肉質(zhì)葉（因受細(xì)麗外擔(dān)菌侵害，外形腫大），拍照后放入無菌牛皮紙袋中，立即帶回實驗室。參照闕生全等分離外擔(dān)子菌的方法分離目標(biāo)菌[7]。根據(jù)油茶葉受侵染的程度，將油茶葉病程劃分成4個等級。

I 級：肉質(zhì)葉——14～17 mm×4～8 mm，深紅色，未脫皮。

II 級：肉質(zhì)葉——19～23 mm×11～14 mm，粉紅色，未脫皮。

III 級：肉質(zhì)葉——45～65 mm×20～26 mm，暗金黃色，部分脫皮。

IV 級：肉質(zhì)葉——75～95 mm×28～34 mm，淺白色，完全脫皮。

1.2 供試試劑

超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、過氧化物酶（POD）測定試劑盒、苯丙氨酸解氨酶（PAL）測定試劑盒和丙二醛（MDA）測定試劑盒。以上試劑盒購自南京建成生物工程研究所。丙酮、黃基水楊酸、三氯乙酸等分析純試劑購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.3 試驗方法

丙二醛含量、葉綠素（a+b）含量、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量的測定，參照王學(xué)奎[20]的方法。超氧化物歧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶3 種酶活性的測定參考南京建成生物工程研究所出具的說明書。

以上所測得數(shù)據(jù)運用SPSS 20.0 軟件和Excel 2007 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素和類胡蘿卜素含量的變化

由表1可知，油茶葉中的總?cè)~綠素含量與對照組呈極顯著差異（P＜0.01）。隨病程加重總?cè)~綠素含量呈下降趨勢（圖1）。在I 級肉質(zhì)葉中，總?cè)~綠素含量為41.05 mg·g-1，是對照組含量的19.58%，而在IV 級中，總?cè)~綠素含量為15.43 mg·g-1。肉質(zhì)葉中的類胡蘿卜素含量變化趨勢與總?cè)~綠素的變化一致（圖2）。在I 級肉質(zhì)葉中總類胡蘿卜素含量是對照組的7.9%，而在IV 級肉質(zhì)葉中類胡蘿卜素含量僅為對照組的2.38%。

表 1 各生理參數(shù)不同組單因素多重比較?Table 1 Multiple comparisons of one-way ANOVA on physiological parameters of Camellia oleifera at control group and different experimental groups

圖1 油茶葉內(nèi)葉綠素含量的變化Fig.1 Changes of the content of chlorophy II in the leaves of Camellia oleifera

圖2 油茶葉內(nèi)類胡蘿卜素含量的變化Fig.2 Changes of the content of carotenoid in the leaves of Camellia oleifera

2.2 可溶性糖含量的變化

由表1可知，受細(xì)麗外擔(dān)菌侵染后油茶葉可溶性糖含量顯著變化（P＜0.01）。本研究結(jié)果表明（圖3），在I 級肉質(zhì)葉中其含量為29.4 mg·g-1，是對照組的2.43 倍。在II 級其含量迅速提高，達(dá)到峰值50.23 mg·g-1，是對照組的4.15 倍。但隨著病程加重含量又急劇下降，在IV 級肉質(zhì)葉中僅為10.37 mg·g-1。

圖3 細(xì)麗外擔(dān)子菌對油茶葉中可溶性糖含量的影響Fig.3 The effect of Exobasidium gracile on the content of soluble sugars in the leaves Camellia oleifera

2.3 脯氨酸含量的變化

脯氨酸是一種細(xì)胞親水性物質(zhì)，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的水和作用，形成聚合物，所以它具有一定的保水作用。由表1可知，受細(xì)麗外擔(dān)菌侵染后油茶葉脯氨酸含量變化顯著（P＜0.01）。結(jié)果（圖4）顯示，在I 級肉質(zhì)葉中脯氨酸含量是46.73 μg·g-1，為對照組的1.94 倍；在II 級肉質(zhì)葉中，脯氨酸的含量上升，為最大值75.54 μg·g-1，是對照組的3.13倍；隨著病情逐漸加重，IV 級時，脯氨酸含量下降到11.25 μg·g-1，為對照組的46.64%。

圖4 細(xì)麗外擔(dān)子菌對油茶葉中脯氨酸含量的影響Fig.4 The effect of Exobasidium gracile on the content of proline in the leaves of Camellia oleifera

2.4 MDA 含量的變化

當(dāng)油茶葉受侵染后，丙二醛（MDA）的含量變化顯著（P＜0.01）（表1）。由圖5知，在I級時，葉肉中MDA 含量為37.42 μmol·g-1，是對照組的2.26 倍。在II 級，MDA 含量迅速增加并達(dá)到峰值63.28 μmol·g-1，是對照組的3.82 倍。病程不斷加重，MDA 含量呈下降趨勢，在IV 級為24.26 μmol·g-1。

圖5 細(xì)麗外擔(dān)子菌對油茶葉中MDA 含量的影響Fig.5 The effect of Exobasidium gracile on the content of MDA in the leaves of Camellia oleifera

2.5 SOD 活性的變化

由表1知，油茶葉受細(xì)麗外擔(dān)菌侵染后超氧化物歧化酶（SOD）活性變化顯著（P＜0.01）。在I 級肉質(zhì)葉中SOD 活性是16.54 U·g-1，為對照組的28.15%，而在IV 級其活性是7.28 U·g-1，僅為對照組的12.39%（圖6）。

圖6 細(xì)麗外擔(dān)子菌對油茶葉中SOD 酶活性的影響Fig.6 The effect of Exobasidium gracile on the content of SOD in the leaves of Camellia oleifera

2.6 POD 活性的變化

由表1知，油茶葉受細(xì)麗外擔(dān)菌侵染后過氧化物酶（POD）活性變化呈極顯著差異（P＜0.01）。在I 級時，油茶葉中POD 活性是163 U·g-1，是對照組的45.03%，而在IV 級其活性是11.8 U·g-1，僅為對照組的32.6%（圖7）。

2.7 PAL 活性的變化

由表1知，葉片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性變化呈極顯著差異（P＜0.01），受病程的不斷加重，其活性先上升至峰值而后急劇下降（圖8）。在I 級肉質(zhì)葉中，PAL 活性為12.6 U·g-1，是對照組的2.25 倍。在II 級迅速上升，達(dá)到峰值，上升幅度為65.08%。在IV 時降至2.6 U·g-1，為對照組的46.43%。

圖7 細(xì)麗外擔(dān)子菌對油茶葉中POD 酶活性的影響Fig.7 The effect of Exobasidium gracile on the content of POD in the leaves of Camellia oleifera

圖8 細(xì)麗外擔(dān)子菌對油茶葉中PAL 酶活性的影響Fig.8 The effect of Exobasidium gracile on the content of PAL in the leaves of Camellia oleifera

2.8 方差分析

單因素方差分析表明，在8 個生理參數(shù)間，除可溶性糖，對照組與IV 級病程組不存在顯著性差異外（P＜0.05）；其余參數(shù)間，對照組與實驗組均存在極顯著差異（P＜0.01）（表1）。

表1顯示，在葉綠素四個實驗組中，I 級病程組與II級、III級病程組，II級病程組與III級病程組，III 級病程組與IV 級病程組不存在顯著或極顯著差異（P＞0.05）；在類胡蘿卜素4 個實驗組中，III級病程組與IV 級病程組不存在顯著或極顯著差異（P＞0.05）；在SOD 4 個實驗組中，III 級病程組與IV 級病程組不存在顯著或極顯著差異（P＞0.05）；其余各實驗組間在選取的8 個生理參數(shù)間均存在顯著或極顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

3 結(jié)論與討論

細(xì)麗外擔(dān)菌感染油茶花芽和幼葉后，使油茶植物組織增生導(dǎo)致一種特殊的“菌癭”為油茶茶餅病[6]。該病發(fā)生具有明顯的季節(jié)性，通常2月開始發(fā)病。油茶茶餅病在發(fā)病期，成熟孢子借風(fēng)傳播侵染寄主，寄主嫩葉在適宜的條件下當(dāng)年春季發(fā)病，如條件不適宜，以菌絲形態(tài)和越夏方式在寄主內(nèi)潛伏，并以代謝物影響寄主的葉芽和花芽，來年早春發(fā)病[9-10]。油茶茶餅病的發(fā)生與氣溫、日照、云量、降水等氣候因子有密切關(guān)系[9]，尤以茂密林分中發(fā)病較重，如通風(fēng)不良、陽光不足等；此外，分蘗油茶嫩枝葉片也是最易感病[21]。特別是月平均氣溫對發(fā)病有顯著的影響[9]，如雨量充足時，細(xì)麗外擔(dān)菌在平均氣溫20～30 ℃時生長有利，易造成很大的侵染和擴展機會[10]。

本研究從葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性糖等8 個生理生化指標(biāo)來有探討病害脅迫與寄主植物間的響應(yīng)關(guān)系。葉綠素是植物光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本試驗結(jié)果表明，油茶病變?nèi)~片的葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著的低于對照組，其含量隨油茶葉片病程不斷嚴(yán)重而顯著的減少。細(xì)麗外擔(dān)菌侵染寄主時，葉綠素和類胡蘿卜素含量從感染部位到未感染部位區(qū)域，有明顯的下降梯度，與病變的程度存在一定的相關(guān)性。由于寄主同一葉片上的感染部位可逐漸發(fā)生，在正常葉片與感染葉片的過渡區(qū)域，葉片含有葉綠體[11]，所以葉綠素和類胡蘿卜素的含量是隨感病程度的增加而減少，存在顯著或極顯著差異。感病葉無柵欄組織和海綿組織的分化，無葉綠體，有別于正常的葉肉細(xì)胞，或存在葉綠體，但葉綠體的雙膜結(jié)構(gòu)被破壞，基粒片層數(shù)減少或消失[11,14]，使葉片喪失光合作用和結(jié)實功能，油茶顯著減產(chǎn)。病原菌逐漸感染，破壞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生過氧化作用或脫脂作用而形成丙二醛（MDA），與對照組相比，實驗組的MDA 的含量增多，MDA 含量在油茶葉片侵入中度時，其含量最大。糖類物質(zhì)可參與植物的抗病性表達(dá)[22-23]，病變中前期葉片可溶性糖含量極顯著地高于對照組，這是因為病菌剛開始時侵染寄主葉片時，感病部位需要較多的糖類物質(zhì)以抵抗病菌的侵入，但隨著病菌大量生長繁殖，加劇了對寄主葉片中葉綠素的破壞，使得感染葉片的光合作用下降，可溶性糖含量隨之下降；另一方面病原菌為異養(yǎng)生物，其自身的生長繁殖需要吸取葉片內(nèi)糖類物質(zhì)，受害葉片糖類物質(zhì)減少?；谟诖?，可溶性糖在病原菌入侵初期，含量顯著增加，在侵入后期含量顯著下降。前人研究也顯示，不同病變位置甜味存在差異，葉“癭體”富含水分，鮮食時甜味比子房“癭體”略淡，清鮮，微澀[12]。但后期葉“癭體”由于失水枯干，其甜味會有所上升。

植物受病原菌侵染后會產(chǎn)生防御反應(yīng)，抗病相關(guān)蛋白的表達(dá)會顯著變化[24-25]。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）作為細(xì)胞抵御活性氧傷害的酶保護系統(tǒng)的重要成員[26-27]，本試驗顯示，SOD、POD 酶活性隨著細(xì)麗外擔(dān)菌侵入的不斷深入，其酶活性不斷減少，與對照組存在顯著差異（表1）。有研究顯示，研究材料接種病原菌后，植物體內(nèi)抗病反應(yīng)與POD 活性之間呈正相關(guān)，如在油茶軟腐病Colletotrichum camelliae研究中[28]，而有關(guān)SOD 酶活性變化與抗病性關(guān)系尚未取得一致的結(jié)論[29]，如常明山等研究顯示SOD表現(xiàn)各異，超SOD 在感病后的陸川油茶植株葉片降低，但普通油茶、岑軟2 號油茶感病后的植株葉片體內(nèi)升高[30]。本試驗結(jié)果為SOD、POD 2 種物質(zhì)在受病原菌侵染后，其酶活性與病程呈負(fù)相關(guān)。說明寄主葉片受病原菌侵染后，體內(nèi)組織代謝發(fā)生紊亂，植物自我調(diào)節(jié)和恢復(fù)能力減弱，也可能在發(fā)病后發(fā)病組織體內(nèi)蛋白水解酶活性提高[31]，分解或降低了所測2 種酶的活性。苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物中起到酚類物質(zhì)聚集、木質(zhì)素積累、植保素合成等的關(guān)鍵酶和限速酶的功效[32]。本試驗結(jié)果表明，油茶葉受病原菌侵染后，PAL 活性發(fā)生顯著性變化。油茶葉剛受侵染時，PAL 活性急劇升高；隨著病程繼續(xù)加重，PAL 的活性呈逐漸下降。這可能是油茶葉在輕度病害脅迫下體內(nèi)誘導(dǎo)了這類保護酶的基因表達(dá)，PAL 活性表現(xiàn)出增加；隨著油茶葉病程加重，其體內(nèi)代謝趨于紊亂導(dǎo)致抑制了這類保護酶基因表達(dá)，PAL活性表現(xiàn)出下降。以上原因的解釋，還需進(jìn)一步的實驗驗證。植物蛋白質(zhì)的變化必然引起蛋白質(zhì)構(gòu)成基本單位氨基酸的變化[12]。脯氨酸與植物抗逆性關(guān)系密切，游離脯氨酸含量是植物體抗逆性生理生化指標(biāo)之一[29]。本研究表明，寄主葉片受病原菌侵染后，其葉片中的游離脯氨酸含量迅速增加，對照組和實驗組脯氨酸含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)存在極顯著差異；脯氨酸在葉片侵入II 級病程時含量最多，隨著細(xì)麗外擔(dān)菌對寄主葉片破壞不斷的加深，其葉片合成脯氨酸的能力下降。在細(xì)麗外擔(dān)菌侵入茶樹Camellia sinensis葉片后，茶樹葉片氨基酸含量也會發(fā)生變化[12]。單治國等研究顯示，茶樹葉片受茶餅病危害后，游離氨基酸總量出現(xiàn)了不同程度的上升，但葉片中苯丙氨酸的含量下降[12]。本試驗顯示，細(xì)麗外擔(dān)菌侵染油茶葉片，葉片中PAL 活性先上升至峰值而后急劇下降，關(guān)于葉片中苯丙氨酸的含量需下一步研究中深入探討。

油茶葉片受細(xì)麗外擔(dān)菌侵染后，其葉片組織內(nèi)的生理代謝活動受到影響，致使油茶葉片光合作用、物質(zhì)代謝、生長和品質(zhì)等造成負(fù)面影響。本研究再次證實了病原菌脅迫能引起寄主植物體內(nèi)的生理生化代謝活動出現(xiàn)不同程度的變化，對這一現(xiàn)象進(jìn)行深入研究，則有可能把該規(guī)律用于油茶茶餅病的早期預(yù)測。