利用猴模型開展神經(jīng)疾病細(xì)胞及基因治療的研究進(jìn)展

彭 靜，周 勤，陳永昌

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200127

2.昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病與非人靈長類模型的特點(diǎn)及優(yōu)勢

1.1 研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用途徑

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能極其復(fù)雜和精密。受精卵逐步發(fā)育為神經(jīng)胚，并進(jìn)一步發(fā)育出中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，其中包括神經(jīng)譜系細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、遷移和分化。神經(jīng)系統(tǒng)的異常發(fā)育和病變會導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的神經(jīng)及精神疾病，包括神經(jīng)管畸形、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)發(fā)育性疾病和神經(jīng)肌病等。研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用途徑包括臨床病例研究、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型等。

臨床病例可以展示疾病的最真實(shí)特征，但是由于往往缺失發(fā)病前以及發(fā)病早期的數(shù)據(jù)，并且很多情況下無法直接開展人體試驗(yàn)，因此難以系統(tǒng)地監(jiān)測疾病的整個發(fā)展過程。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)能夠模擬體內(nèi)發(fā)育過程，初步探索疾病的發(fā)病機(jī)制。體外分化及擴(kuò)增的細(xì)胞也是開展細(xì)胞替代治療研究的重要材料。

建立動物模型是研究生命的發(fā)生和發(fā)展、基因功能以及疾病不可或缺的重要手段。動物模型可以模擬臨床患者，系統(tǒng)收集發(fā)病前、發(fā)病早期以及病程的特點(diǎn)、開展發(fā)病機(jī)制和治療研究?；谀Ｊ絼游锏难芯吭诨A(chǔ)研究和應(yīng)用研究中均得到了應(yīng)用，并且在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)方面取得了重大進(jìn)展，使人們對分子、細(xì)胞、生理和心理等生物學(xué)過程有了更加科學(xué)的認(rèn)識。有效的動物模型也是藥物研究和開發(fā)流程必不可少的環(huán)節(jié)。

1.2 神經(jīng)系統(tǒng)疾病與非人靈長類模型

通過建立適合的神經(jīng)疾病模型，能夠有效地促進(jìn)神經(jīng)疾病的機(jī)制研究和治療的研發(fā)。目前，作為疾病模型的動物有線蟲、果蠅、斑馬魚、爪蟾、雞和小鼠等，其中應(yīng)用最為廣泛的是小鼠。然而，基于小鼠模型的藥物研發(fā)成果能夠最終應(yīng)用于臨床的成功率低于5%，并且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域的應(yīng)用率更低，因此尋找更加適合的神經(jīng)疾病模型至關(guān)重要。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，非人靈長類模型的優(yōu)勢顯得尤為突出。首先，在基因組相似度方面，人與猴為95%，人與狗為83%，人與鼠為84%。雖然小鼠與人的基因數(shù)量相似（約有20 000個基因）且保守性高，但是轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)存在4 000多個差異性表達(dá)基因，并且表觀遺傳學(xué)水平的調(diào)控差異巨大。研究報道，在RNA表達(dá)水平上，人與鼠之間的差異巨大，這種差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了以往研究報道的結(jié)果，并且這種差異同樣存在于非編碼基因和保守的編碼基因上[1]。其次，在大腦結(jié)構(gòu)與功能的相似度方面，人與猴均有高度發(fā)達(dá)的前額葉皮質(zhì)，控制著高級認(rèn)知功能，而嚙齒類動物與人腦在皮質(zhì)的發(fā)達(dá)程度、表面積以及體積等方面，均存在巨大差異。由此可見，小鼠模型并不能很好地模擬人類神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及神經(jīng)和精神疾病。

非人靈長類模型的另一個優(yōu)勢是它們屬于非近交系，并且生活環(huán)境較為復(fù)雜，其生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、四肢功能及運(yùn)動特點(diǎn)、睡眠節(jié)律（晝行夜宿）以及代謝等均與人類具有相似性。因此，非人靈長類動物是模擬人類神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)疾病最理想的實(shí)驗(yàn)動物。

2 非人靈長類模型在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用展現(xiàn)出廣闊前景

目前，利用非人靈長類動物建立實(shí)驗(yàn)動物模型的方法有自然選擇法、藥物誘導(dǎo)法、物理損傷法和基因工程法（包括傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因法和靶向基因編輯技術(shù)）。借助輔助生殖技術(shù)體系，可以通過精子載體法、體細(xì)胞核移植法、受精卵雄原核顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法和胚胎干細(xì)胞法等方法建立基因修飾動物模型。

2.1 轉(zhuǎn)基因

通過基于慢病毒的轉(zhuǎn)基因法已成功獲得轉(zhuǎn)基因猴。2001年，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體注射法創(chuàng)建了表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的轉(zhuǎn)基因恒河猴[2]。這項(xiàng)開創(chuàng)性的工作開辟了一個新紀(jì)元，此后又創(chuàng)建了多個可用于模擬不同腦部疾病的轉(zhuǎn)基因猴。YANG等[3]于2008年建立了首個亨廷頓?。℉untington's disease）的非人靈長類動物模型，利用慢病毒將導(dǎo)致亨廷頓病的HTT突變基因轉(zhuǎn)染至猴的合子中[3]，經(jīng)胚胎移植出生的猴模型表現(xiàn)出神經(jīng)元死亡和運(yùn)動缺陷的跡象。2015年，NIU等[4]獲得了表達(dá)突變型α-突觸核蛋白（A53T）的轉(zhuǎn)基因帕金森病猴模型。2016年，LIU等[5]成功建立了在神經(jīng)系統(tǒng)中特異性過表達(dá)MECP2基因的轉(zhuǎn)基因自閉癥食蟹猴模型，該模型表現(xiàn)出不良的社會互動。

2.2 基因編輯

利用新興的基因編輯工具可以高效且精確地對目的基因開展靶向編輯。例如，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已被廣泛地應(yīng)用于多個物種的基因組編輯。2014年，NIU等[6]首先應(yīng)用Cas9 mRNA和sgRNA編輯食蟹猴的基因。隨即，LIU等[7]采用TALEN質(zhì)粒構(gòu)建出首個非人靈長類動物模型，獲得了出生即攜帶MECP2基因突變的雌性食蟹猴。同時，LIU等[8]團(tuán)隊(duì)也利用TALEN mRNA獲得了攜帶MECP2基因突變的食蟹猴組織，但模型猴未能存活。2015年，CHEN等[9]應(yīng)用CRISPR/Cas9靶向抗肌萎縮蛋白基因建立了進(jìn)行性假肥大性肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）猴模型。

2016年，KE等[10]利用TALEN制備了一個攜帶雙等位基因MCPH1突變的食蟹猴模 型。2017年，CHEN等[11]利 用TALEN靶向修飾MECP2基因建立雷特綜合征（Rett syndrome）食蟹猴模型。同時，ZHAO等[12]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對獼猴胚胎中的SHANK3基因進(jìn)行改造，成功獲得3個存在獨(dú)特基因突變的后代，其中一個猴模型存活了下來。有學(xué)者利用CRISPR/Cas9技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功構(gòu)建了世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型，該模型表現(xiàn)出晝夜節(jié)律紊亂和精神分裂等癥狀[13]。2012年獲得了SHANK3基因突變的猴子，這些猴子表現(xiàn)出一些特定的類似于人類自閉癥患者的行為特征以及大腦連接方式[14]。因此，目前已逐步有效地建立起神經(jīng)系統(tǒng)疾病的猴模型，具有廣泛的應(yīng)用前景。

3 干細(xì)胞替代治療在非人靈長類疾病模型中的研究進(jìn)展

近年來，阿爾茨海默病、帕金森病、額顳葉癡呆、路易體癡呆、多系統(tǒng)萎縮、進(jìn)行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于患病人群龐大，給患者、家屬和社會均帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，且治療手段極為有限。這些疾病具有共同的病理特征，即存在神經(jīng)元的退變，包括錯誤折疊蛋白或異常蛋白質(zhì)聚集、溶酶體缺失、線粒體功能紊亂以及RNA平衡的破壞，同時伴有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的改變和炎癥的形成。

當(dāng)前，以神經(jīng)干細(xì)胞治療為代表的細(xì)胞替代治療有望成為治療這些疾病的新手段。神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有自我更新和增殖能力的細(xì)胞，具有分化為多種神經(jīng)細(xì)胞的潛力，包括神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等，在胚胎發(fā)生和神經(jīng)再生中具有重要作用[15]。DAADI等[16]總結(jié)了非人靈長類動物模型在轉(zhuǎn)化再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)況，指出靈長類動物的干細(xì)胞技術(shù)可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和藥物研發(fā)中，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以直接取自患者或非人靈長類動物的成年體細(xì)胞活檢樣本，或者從組織庫中的存檔標(biāo)本中進(jìn)行提取。對這些組織或胚泡來源的多能干細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，有針對性地糾正突變基因或有缺陷的基因，再使其分化為器官特異性的功能性細(xì)胞。這些細(xì)胞不僅是細(xì)胞治療的關(guān)鍵材料，還是建立體外藥物篩選與機(jī)制研究平臺的重要材料[16]。

有研究證實(shí)，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）來源的多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞能在藥物誘導(dǎo)的帕金森病猴模型的腦中存活并且發(fā)揮功能，改善帕金森病猴模型的自主運(yùn)動能力。有趣的是，來源于帕金森病患者的iPSC與健康人的細(xì)胞一樣，都可以作為細(xì)胞替代治療的備選[17]。中國科學(xué)家也已經(jīng)證實(shí)，臨床級別的人孤雌生殖胚胎干細(xì)胞（human parthenogenetic embryonic stem cell，hPESC）是治療帕金森病的可靠細(xì)胞來源，并且可使非人靈長類帕金森病模型動物的運(yùn)動功能得到恢復(fù)[18]。此外，神經(jīng)干細(xì)胞在治療神經(jīng)退行性疾病的過程中，可以發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)支持的作用[19]。

越來越多的研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)合細(xì)胞、生物材料、生物分子及其組合的微創(chuàng)再生療法（minimally invasive and regenerative therapeutics，MIRET）以微創(chuàng)的方式將干細(xì)胞輸送至體內(nèi)，以再生不同的組織（如骨骼、軟骨、胰腺、心臟、骨骼肌、肝臟、皮膚和神經(jīng)組織等），具有高產(chǎn)率、低風(fēng)險和低成本的特點(diǎn)，有望在臨床中得到更為廣泛的應(yīng)用[20]。

4 基因治療在非人靈長類疾病模型中的研究進(jìn)展

神經(jīng)退行性疾病過程通常涉及功能紊亂的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的逐漸積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對于已知致病基因的神經(jīng)疾病，可以進(jìn)行基因治療以表達(dá)正?；蚧蛱鎿Q、沉默和糾正錯誤基因。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）和慢病毒載體（lentiviral vector，LV）具有相對安全且高效的特點(diǎn)，常常被選為神經(jīng)疾病基因治療的遞送載體[21]，如AAV2已成為神經(jīng)外科基因治療的金標(biāo)準(zhǔn)，并且已經(jīng)開展了多項(xiàng)臨床Ⅰ期試驗(yàn)[22-26]和Ⅱ期試驗(yàn)[27-28]。

4.1 帕金森病

迄今為止，在針對帕金森病的AAV2介導(dǎo)的基因治療臨床試驗(yàn)中，已經(jīng)采用了2種治療策略。

第1種治療策略是谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）基因轉(zhuǎn)移。AAV2-GAD策略的重點(diǎn)是將GAD傳遞至底丘腦核（subthalamic nucleus，STN）以努力增加局部的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），抑制并糾正該基底神經(jīng)節(jié)節(jié)點(diǎn)病理的過度活躍。盡管已經(jīng)觀察到向STN注射GABA受體激動劑麝香酚可以減輕帕金森病的運(yùn)動癥狀[29]，但是將AAV2-GAD遞送至1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的帕金森病猴模型的STN后，模型猴的運(yùn)動功能并未得到改善。一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)向患者的癥狀性半球STN單側(cè)輸注AVV2-GAD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STN活性降低，由此證實(shí)了基因轉(zhuǎn)移的有效性[30]。在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，帕金森病患者接受AAV2-GAD雙側(cè)輸注后，其運(yùn)動癥狀得到了改善，但改善的效果不如深部腦刺激STN。

第2種治療策略是左旋芳香族氨基酸脫羧酶（aromaticL-amino acid decarboxylase，AADC）基因轉(zhuǎn)移。AADC基因治療是一種前藥方法，紋狀體已被選為該療法的靶標(biāo)。臨床前研究表明，將人類AADC遞送至MPTP誘導(dǎo)的猴模型后，其行為評分得到了長期的顯著改善，降低了左旋多巴的需要量，減少了左旋多巴的不良反應(yīng)。此外，帕金森病猴模型接受人類AADC輸注后9年，其正電子發(fā)射計算機(jī)體層顯像（positron emission tomography and computed tomography）結(jié)果顯示AADC持續(xù)過度表達(dá)，表明該療法具有長期療效[31-32]。

4.2 亨廷頓病

基因治療也是治療亨廷頓病的潛在思路，可以直接靶向功能異常的細(xì)胞核，從而降低突變型亨廷頓蛋白（mutant huntingtin，mHtt）的水平。亨廷頓病的臨床前基因治療策略主要集中于應(yīng)用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)抑制mHtt的病理水平。此外，非人靈長類動物的研究表明，正常亨廷頓蛋白水平下降45%可能是可以被接受的[33-34]。

4.3 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病與邁納特基底核（basal nucleus of Meynert）膽堿能神經(jīng)元的丟失有關(guān)，而膽堿酯酶抑制劑依然是阿爾茨海默病的主要治療手段，但總體上對癥狀僅有輕微的改善。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）增強(qiáng)了膽堿能神經(jīng)元在基底前腦中的功能，這種作用已在老年猴和患有病變的動物中得到了證實(shí)[35]。細(xì)胞治療和基因治療均有望應(yīng)用于阿爾茨海默病的治療研究。

4.4 基因治療的安全性和有效性

雖然針對神經(jīng)退行性疾病的基因治療Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)動物均取得了一些令人鼓舞的結(jié)果，支持了基于AAV和LV的神經(jīng)退行性疾病基因治療的可行性和有效性[36-37]，但是要證明基因治療的安全性和有效性，仍需克服諸多障礙，例如治療的靶向性、治療效果的穩(wěn)定維持時間以及免疫排斥反應(yīng)等[38]。此外，需要不斷地優(yōu)化體內(nèi)給藥途徑和參數(shù)（注射量、流量和注射次數(shù)），以實(shí)現(xiàn)廣泛的轉(zhuǎn)導(dǎo)?？傊?，目前離全面的基因治療還有一段很長的路要走。

5 結(jié)語

非人靈長類動物與人類在多個方面，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)方面的相似性，使其成為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的最理想模型。隨著越來越多神經(jīng)系統(tǒng)疾病猴模型的出現(xiàn)，以及伴隨著細(xì)胞分化、基因編輯和組織工程等方面的綜合進(jìn)展，利用猴模型開展神經(jīng)疾病的細(xì)胞治療和基因治療的前景將會更為廣闊，有望加快神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床前研究進(jìn)程。