組織透明化技術(shù)在非人靈長類神經(jīng)退行性疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

莊旭東 王心睿

神經(jīng)退行性疾病，是由于大腦和脊髓的神經(jīng)元或其髓鞘缺失，隨著時間的推移而惡化，導(dǎo)致運動（共濟(jì)失調(diào)）或精神（癡呆）功能問題，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等疾病，大部分不可治愈，造成了巨大的社會負(fù)擔(dān)[1-2]。

一直以來，小鼠是研究神經(jīng)退行性疾病的常用模型，因為不能完全模擬人類神經(jīng)退行性疾病的真實情況或在神經(jīng)退行性病變的治療中發(fā)揮作用，所以不能廣泛用于神經(jīng)退行性疾病研究[3]。非人靈長類和人同屬哺乳綱的靈長目，不論從基因組到神經(jīng)解剖學(xué)，還是從免疫系統(tǒng)到行為學(xué)等方面，都與人類高度相似，是研究人類神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制和治療方法的關(guān)鍵動物模型[4-6]。

眾所周知，自然界中斑馬魚的胚胎是透明的，有利于科學(xué)研究[7-8]。絕大多數(shù)生物由于內(nèi)、外源性色素的存在、組織成分不同及其不均勻分布引起折射率的差異，生物組織高度不透明。有研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動物研究中開發(fā)的組織透明化技術(shù)，適用于非人類靈長類動物[9-10]。非人靈長類動物經(jīng)組織透明化技術(shù)處理，結(jié)合光學(xué)成像、熒光標(biāo)記和數(shù)據(jù)整理與分析，理論上不僅能從立體上完整觀察非人靈長類神經(jīng)退行性疾病動物模型，獲得高分辨率的器官、組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)信息；還能從全局研究完整非人靈長類神經(jīng)退行性疾病動物模型的宏觀、介觀和微觀的生命現(xiàn)象和生物活動規(guī)律[11-12]。

一、組織透明化

組織透明化是通過不同化學(xué)試劑的組合使用結(jié)合浸泡、灌注、電泳等各種滲透方式，脫脂、脫色、脫鈣和擴(kuò)張，改變折射系數(shù)（refractive index，RI），使得樣品的RI 與成像介質(zhì)的RI趨近一致，減少光線折射，增加鏡下視野亮度，提高組織器官樣本透明度，最后實現(xiàn)3D 成像，立體觀察完整的生物體[13]。

目前組織透明化有3 種主要的方法：疏水法、親水法和水凝膠法。疏水法：主要包括溶劑清除器官的三維成像（threedimensional imaging of solvent cleared organs，3DISCO）、極限3DISCO、免疫標(biāo)記的3DISCO（immunolabelling-enabled 3DISCO，iDISCO）和重鏈抗體的可變域3DISCO（variable domain of heavy-chain antibodies 3DISCO，vDISCO）；依賴于組織的完全脫水，使用有機(jī)溶劑進(jìn)行脫水、脫脂和RI 匹配，可以快速有效透明組織且易于成像和保存，但可能收縮組織和漂白熒光蛋白。親水法：主要包括基于尿素的透明技術(shù)Sca/e、深部腦成像（see deep brain，SeeDB）、清晰且無阻礙的大腦或整體成像方法（clear,unobstructed brain or body imaging cocktails and computational analysis，CUBIC）、基于尿素和山梨醇的透明方案Sca/eS 和SeeDB2；基于水溶性溶液，比疏水法具有更高的生物安全性和相容性，過程包括脫色、脫脂和RI 匹配，但可能會擴(kuò)張組織和需要更長的孵育時間。水凝膠法：主要包括清晰脂質(zhì)交換丙烯酰胺雜交精細(xì)成像相容性組織水凝膠法（clear lipid-exchanged acrylamide hybridized rigid imagingcompatible tissuehydrogel，CLARITY）、原位灌注輔助藥物釋放透明法、X 倍擴(kuò)展CUBIC、環(huán)氧化物交聯(lián)保護(hù)快速透明法、通用型組織染色成像法（CUBIC-HistoVIsion）和小膠束介導(dǎo)的人體器官透明化和標(biāo)記[14-15]；使用單體和引發(fā)劑分子或聚環(huán)氧化物合成凝膠，進(jìn)行脫脂和RI 匹配，既可多重標(biāo)記，又保留著高分子蛋白、DNA 和RNA，還可使組織擴(kuò)張數(shù)倍，但要求更長的孵育時間或是輔助處理設(shè)備。

這些組織透明化方法的選擇使用，要結(jié)合生物體組織器官的物理特性和實驗?zāi)康木C合考慮[16]。

二、組織透明化應(yīng)用在非人靈長類神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性和異質(zhì)性導(dǎo)致研究進(jìn)程緩慢，其中神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展涉及多種不同的細(xì)胞類型、錯綜復(fù)雜的神經(jīng)回路和信號通路，組織透明化初步實現(xiàn)嚙齒類與非人靈長類動物的大腦3D 成像，與大體解剖和二維切片相比，更有利于研究神經(jīng)退行性疾病的復(fù)雜性，有望為人類神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制研究和治療提供有力支持。

（一）AD

由于影響AD 發(fā)展的遺傳因素和環(huán)境因素非常復(fù)雜，AD的發(fā)病機(jī)制至今尚未得到充分的研究[17]。細(xì)胞外老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD 的2 個病理特征[18]。細(xì)胞外老年斑主要存在于海馬體和新皮質(zhì)，是Aβ 在神經(jīng)元之間的異常積累和聚集而成，而神經(jīng)纖維纏結(jié)與tau 蛋白的過磷酸化有關(guān)，從海馬狀突起擴(kuò)散到大腦的不同區(qū)域中，破壞腦功能，引起患者的認(rèn)知能力下降和記憶喪失[19-20]。

Ando 等[21]比較了CLARITY、Sca/e、SeeDB 和3DISCO 等組織透明方法，認(rèn)為CLARITY 更適合于立體觀察AD 患者大腦皮層中Aβ 分布和聚集在神經(jīng)元周圍的變性的tau 蛋白。Liebmann 等[22]借助iDISCO 立體觀察Aβ 在AD 模型小鼠大腦中的分布和磷酸化tau 的擴(kuò)散方式，分析斑塊的形成和分布。Vints 等[23]通過CUBIC 結(jié)合熒光染料可使單個神經(jīng)元3D成像，觀察AD 小鼠中Aβ 在神經(jīng)元的不同階段所引起的形態(tài)變化?，F(xiàn)有的非人靈長類AD 模型建立方法很多，開發(fā)轉(zhuǎn)基因非人靈長類AD 模型或接種AD 患者的大腦勻漿，在藥物開發(fā)和免疫療法研究中能夠發(fā)揮更好的作用[24-26]。通過非人靈長類AD 動物模型結(jié)合組織透明化技術(shù)，有利于觀察AD神經(jīng)元的退行性病變和Aβ、tau 蛋白等之間的演變過程，闡明AD 的潛在發(fā)病機(jī)制和藥物靶點。

（二）ALS

ALS 的病因、病理并不明確，主要累及大腦皮質(zhì)運動區(qū)錐體細(xì)胞和腦神經(jīng)核、脊髓前角細(xì)胞，主要病理改變是TDP-43蛋白在細(xì)胞質(zhì)積累、運動神經(jīng)元的減少和殘存神經(jīng)元的變性，主要臨床表現(xiàn)為延髓支配四肢、軀干肌肉的無力和萎縮，最終惡化導(dǎo)致呼吸肌無力而窒息死亡[27-29]。

Hruska 等[30]將CUBIC 與受激發(fā)射減損顯微鏡相結(jié)合，3D成像觀察到小鼠脊髓樹突細(xì)胞與突觸前后的蛋白的量有關(guān)。Morawski 等[31]應(yīng)用CLARITY 在人腦樣本，3D 成像觀察了大腦皮層介觀現(xiàn)象、皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)和髓鞘纖維分布。Lee等[32]將ACT-PRESTO 應(yīng)用在人類脊椎樣本，實現(xiàn)脊椎3D 成像的結(jié)構(gòu)觀察。非人靈長類ALS 動物模型在各方面優(yōu)于嚙齒類動物模型，特別是在研究TDP-43 蛋白錯誤積累與錯誤定位和相關(guān)蛋白質(zhì)包涵體方面[33]；在非人靈長類ALS 動物模型大腦中觀察到caspase-4 調(diào)節(jié)TDP-43 蛋白在胞質(zhì)中的錯誤定位，而且與嚙齒類動物模型有所不同[34]。非人靈長類ALS動物模型與組織透明化技術(shù)結(jié)合，易于觀察ALS 中運動神經(jīng)元的數(shù)量變化、變性特點和TDP-43 蛋白的錯誤積累和錯誤定位，從三維可視化角度闡述ALS 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

（三）MS

MS 是一種進(jìn)展性、炎癥性脫髓鞘病，累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個部位，不同部位發(fā)病引起不同的臨床表現(xiàn)，而且反復(fù)發(fā)作。病理特點是皮質(zhì)脫髓鞘和神經(jīng)-軸索、突觸的缺失，靶點是丘腦、海馬等灰質(zhì)結(jié)構(gòu)。主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腦、脊髓和視神經(jīng)損傷。其中實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是一種廣泛應(yīng)用于MS 模型的臨床前研究新療法和潛在發(fā)病機(jī)制[35-37]。

Erturk 等[38]借助3DSICO 研究和測定小鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目變化，分析脊髓傷后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)特點和軸突再生軌跡。Spence 等[39]借鑒改良的CLARITY 方法，研究表明MS灰質(zhì)萎縮與軸突膨大的數(shù)目有關(guān)，提供髓鞘再生的治療靶點和策略。有研究發(fā)現(xiàn)非人靈長類EAE 動物模型可以彌補(bǔ)嚙齒類動物EAE 模型模型與MS 患者之間的差異，觀察到非人靈長類MS 動物模型白質(zhì)和灰質(zhì)中脫髓鞘情況可以初步判斷病情進(jìn)展，輔助診斷和治療[40-41]。結(jié)合組織透明技術(shù)觀察非人靈長類MS 動物模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個部位的脫髓鞘和神經(jīng)元、軸突的缺失現(xiàn)象，對研究MS 的整體水平十分重要。

（四）PD

PD 是一種與α-突觸核蛋白基因突變有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，特征性病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性退變和路易小體形成，導(dǎo)致紋狀體區(qū)多巴胺遞質(zhì)減少，從而患者出現(xiàn)臨床上最經(jīng)典的癥狀：靜止性震顫和肢體僵硬[42-44]。

Liu 等[45]應(yīng)用CLARITY 方法、3D 成像觀察和分析PD 患者組織和小鼠大腦的路易小體形態(tài)及其空間定位和單突觸多巴胺能神經(jīng)元，Menegas 等[46]憑借CLARITY 方法可視化觀察位于小鼠腦中的紋狀體、皮層、杏仁核的單突觸多巴胺能神經(jīng)元，研究多巴胺神經(jīng)回路機(jī)制。Morissette 和Di Paolo[47]認(rèn)為非人靈長類PD 動物模型是實驗減少或抑制過表達(dá)的α-突觸核蛋白是PD 關(guān)鍵的治療靶點的關(guān)鍵模型。Seo 等[48]認(rèn)為1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)引起黑質(zhì)細(xì)胞的大量缺失和存在類路易小體包涵體的慢性非人靈長類PD 動物模型，適合于行為學(xué)評價。組織透明化結(jié)合非人靈長類PD 動物模型和透明化技術(shù)，對闡述多巴胺的功能及其對神經(jīng)元的作用機(jī)制更有利。

三、總結(jié)與展望

組織透明化技術(shù)在非人靈長類中的應(yīng)用已有報道，表明其應(yīng)用于研究非人靈長類動物的神經(jīng)退行性疾病具有可行性[9-10]。但是，組織透明化技術(shù)存在以下技術(shù)局限性：（1）熒光蛋白的淬滅。在透明過程中，使用的化學(xué)試劑難免會加速熒光蛋白的淬滅，不利于光學(xué)成像。因此如何在透明過程減少熒光信號的淬滅、保留蛋白和核酸等的抗原性，還需要進(jìn)一步的研究；（2）樣本的變形。在透明過程中，化學(xué)試劑的作用影響樣本的理化性質(zhì)，比如親水法和水凝膠法會引起組織擴(kuò)張，疏水法則會導(dǎo)致組織皺縮，改變了樣本原有的結(jié)構(gòu)信息；（3）光學(xué)成像。如何實現(xiàn)樣品大小、信噪比、掃描速度、成像深度和分辨率的高效、靈活配置，適用透明化的完整大型生物體的成像，需要多學(xué)科合作。當(dāng)然亟需改進(jìn)的方面還有很多，比如透明的過程繁瑣耗時和試劑昂貴不利于推廣使用，透明化組織的保存、數(shù)據(jù)整理與分析、有機(jī)溶劑的毒害性等。

綜上所述，通過對非人靈長類動物神經(jīng)器官透明化，或?qū)崿F(xiàn)3D 觀察和分析非人靈長類結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)細(xì)胞；通過對非人靈長類動物的全身組織器官透明化，進(jìn)行高通量的3D 成像，有望應(yīng)用于藥物開發(fā)；通過對非人靈長類動物的組織樣本透明化，進(jìn)行3D 成像，有利于發(fā)現(xiàn)更多的疾病相關(guān)的細(xì)胞，提高實驗診斷的敏感性和準(zhǔn)確性。組織透明化技術(shù)應(yīng)用于非人靈長類退行性疾病動物模型的研究，引導(dǎo)人們系統(tǒng)、整體去獲取生物體結(jié)構(gòu)和功能信息，轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，或?qū)⒔鉀Q許多疑難雜癥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突