全身麻醉劑激活杏仁核內(nèi)一個(gè)強(qiáng)效的中樞鎮(zhèn)痛環(huán)路

1.研究背景

全身麻醉(general anesthesia, GA)的主要作用之一是鎮(zhèn)痛，這是保證外科手術(shù)和其他有創(chuàng)性醫(yī)療操作更加人性化的關(guān)鍵。眾所周知GA 能使意識(shí)消失，通常認(rèn)為鎮(zhèn)痛是無(wú)意識(shí)的大腦無(wú)法感受疼痛的結(jié)果。然而根據(jù)許多術(shù)中覺(jué)醒的案例，病人可以感知手術(shù)室內(nèi)醫(yī)師的談話或其他事件，但不感覺(jué)到疼痛，這表明體內(nèi)可能存在一種特殊的不依賴意識(shí)消失的麻醉通路。此外，氯胺酮作為常用的全身麻醉藥，臨床麻醉醫(yī)師常常使用其低劑量進(jìn)行鎮(zhèn)痛，不僅不會(huì)引起意識(shí)喪失，而且對(duì)生理功能的影響也微乎其微。先前認(rèn)為，低劑量全身麻醉藥之所以能夠鎮(zhèn)痛是因?yàn)樗幬镒钄嗔送庵軅π孕畔⒃诩顾璞辰堑膫鬟f，然而接受低劑量全身麻醉藥的病人雖然不會(huì)感到疼痛但仍可感知到疼痛的刺激，這表明低劑量的全身麻醉藥鎮(zhèn)痛可能在脊髓以上的高級(jí)中樞起作用，從而將痛感覺(jué)和對(duì)刺激本身的感知區(qū)別開(kāi)來(lái)。而具體哪些腦區(qū)和神經(jīng)元參與這一作用，尚不清楚。研究者假設(shè)全身麻醉藥產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與特定的中樞疼痛抑制回路的激活有關(guān)。隨后發(fā)現(xiàn)全身麻醉藥激活了CeA 中特定的GABA 能神經(jīng)元；這些神經(jīng)元的激活具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用，可以抑制正常、急性痛和慢性神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠的疼痛感覺(jué)和負(fù)性情緒，并且為低劑量氯胺酮緩解疼痛所必需。

2.主要研究方法

本研究主要采用CANE，一種基于病毒遺傳學(xué)理論使用Fos 標(biāo)記激活的神經(jīng)元的方法，探究GA 激活的神經(jīng)元及其細(xì)胞類型。該實(shí)驗(yàn)利用FosTVA小鼠以及改造后的慢病毒CANE-LV-Cre，使小鼠被激活的Fos+神經(jīng)元表達(dá)TVA 受體，注射CANE-LV-Cre 病毒感染TVA+的神經(jīng)元使其表達(dá)Cre 重組酶，再利用AAVFlex-GFP 驅(qū)動(dòng)GFP 基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)標(biāo)記激活的神經(jīng)元的目的。在GFP 基因充分表達(dá)超過(guò)3 周后，再以相同或不同的刺激再次誘導(dǎo)Fos 表達(dá)；采用鈣成像的方法探究該神經(jīng)元在全身麻醉藥誘導(dǎo)和維持階段的活動(dòng)狀態(tài)；結(jié)合光遺傳技術(shù)操控該神經(jīng)元，利用福爾馬林疼痛模型、慢性壓迫性損傷(CCI)模型及條件位置偏好(CPP)/厭惡(CPA)實(shí)驗(yàn)，探究小鼠的痛相關(guān)行為學(xué)變化；順向示蹤技術(shù)和Fos 免疫組化染色，結(jié)合光遺傳學(xué)技術(shù)探究該神經(jīng)元的下游腦區(qū)及其功能。

3.主要研究結(jié)果

（1）鑒定異氟烷和氯胺酮等全身麻醉藥物激活的CeAGA神經(jīng)元

本文作者利用Fos 作為即刻激活神經(jīng)元的標(biāo)記，尋找暴露于異氟烷全身麻醉2 h 后Fos+神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)三個(gè)Fos+神經(jīng)元亞群，分別位于CeA、終紋床核卵圓分支(ovBNST)和視上核(SON)內(nèi)。該研究重點(diǎn)關(guān)注了CeA 中全身麻醉藥激活的Fos+神經(jīng)元。

值得注意的是，腹腔注射氯胺酮和甲苯嗪 (xylazine, K/X) 同樣能夠誘導(dǎo)Fos+在CeA 細(xì)胞亞群中表達(dá)，并把這類神經(jīng)元稱作CeAGA神經(jīng)元。本文作者首先利用分子標(biāo)記物來(lái)鑒定CeAGA細(xì)胞的類型。將vGat-Cre: Rosa-stop-GFP 小鼠暴露于異氟烷，因?yàn)樵撔∈笏械腉ABA 帶有GFP 熒光，結(jié)果顯示CeAGA神經(jīng)元均為GABA 能。原位雜交雙標(biāo)和免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)顯示大部分CeAGA神經(jīng)元不表達(dá)生長(zhǎng)抑素(Sst)，強(qiáng)啡肽原(Pdyn)，神經(jīng)降壓素(Nts)或CGRP受體(Calcrl)。盡管沒(méi)有觀察到所有CeAGA神經(jīng)元都表達(dá)的特異性基因，但發(fā)現(xiàn)其中一些CeAGA神經(jīng)元表達(dá)前腦啡肽(Penk)或蛋白激酶C (Pkc-d)。三色雜交鏈反應(yīng)(HCR)原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)總的CeAGA神經(jīng)元有51.9%±7.8%表達(dá)Penk1；79.2%±12.6%表達(dá)Pkc-d，而Pkc-d+細(xì)胞中有61.5%±14.5%是Fos+細(xì)胞。該結(jié)果表明GA 激活了CeA 中的一類異質(zhì)性神經(jīng)元群體。

（2）CANE 證明 GA 激活CeA 中一類共同的神經(jīng)元集群

由于無(wú)法用一種分子標(biāo)記物來(lái)特異性標(biāo)記所有CeAGA細(xì)胞，本文作者采用了CANE 方法對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記和操控。將CANE-LV-Cre 和AAV-Flex-GFP 注射到異氟烷全身麻醉2 h 后的小鼠CeA 中，在CeAGA神經(jīng)元中表達(dá)GFP 進(jìn)行標(biāo)記。3 周后小鼠再次暴露于異氟烷并進(jìn)行Fos 免疫熒光染色。研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的細(xì)胞第2 次暴露于異氟烷后又重新表達(dá)Fos。表明CANE 能夠高效特異地標(biāo)記CeAGA神經(jīng)元。將CANEISO-GFP 標(biāo)記的小鼠暴露于K/X 和右美托咪定(Dex)進(jìn)行麻醉。分別有39.0%±7.1%和51.0%±8.1%的CANEISO-GFP+細(xì)胞重新表達(dá)Fos，這表明CeA 中存在一類CeAGA神經(jīng)元亞群，可被多種不同GA 藥物激活。但由于異氟烷能在CeA 中穩(wěn)定地誘導(dǎo)出最大數(shù)量的Fos+神經(jīng)元，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)都使用CANE與異氟烷麻醉結(jié)合的方法來(lái)標(biāo)記CeAGA神經(jīng)元。

（3）異氟烷和氯胺酮麻醉作用下CeAGA神經(jīng)元的在體成像

本文作者使用活體鈣成像探究CeAGA神經(jīng)元在全身麻醉誘導(dǎo)和維持階段的活動(dòng)狀態(tài)。異氟烷全身麻醉 FosTVA小鼠2 h，在CeA 中注射CANE-LV-Cre 和AAV2/1- CAG-Flex-GCaMP6m。將小鼠再次暴露于異氟烷激活了CANE-GCaMP6m 標(biāo)記的CeAGA神經(jīng)元。發(fā)現(xiàn)在異氟烷GA 期間，激活的神經(jīng)元中有89.7% (523/583)熒光增強(qiáng)，而極少數(shù)(10.3%, 60/583)熒光減弱，認(rèn)為少數(shù)表現(xiàn)為異氟烷抑制細(xì)胞可能是由于CANE 標(biāo)記時(shí)背景Fos 造成的非特異性結(jié)果。在激活的神經(jīng)元中，一部分神經(jīng)元本底活性非常低，可被異氟烷顯著激活；而另一部分神經(jīng)元有自發(fā)放電，可被異氟烷進(jìn)一步激活。作者還根據(jù)小鼠接觸異氟烷的最后10 min (10～20 min)與最初10 min (0～10 min)CeAGA神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度的比值，對(duì)神經(jīng)元進(jìn)一步分析，其中11.8% (69/583)的神經(jīng)元表現(xiàn)為持續(xù)性發(fā)放，而77.9% (454/583)的神經(jīng)元僅僅在0～10 min 放電增加，表現(xiàn)為瞬態(tài)發(fā)放。該結(jié)果表明，異氟烷的瞬時(shí)激活足以誘導(dǎo)和/或維持CeAGA神經(jīng)元中Fos 表達(dá)，從而使CANE 標(biāo)記這些細(xì)胞成為可能。接下來(lái)探究低劑量異氟烷(0.5%)是否可以更長(zhǎng)時(shí)程地激活神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)在各個(gè)成像時(shí)相，均存在異氟烷持續(xù)性激活神經(jīng)元和瞬時(shí)性激活神經(jīng)元。此外，采用多種定量分析方法進(jìn)一步證明大多數(shù)CeAGA神經(jīng)元可被異氟烷重新激活。值得注意的是，CeAGA神經(jīng)元的不同放電模式與其分子構(gòu)成的異質(zhì)性的觀點(diǎn)相吻合。作者進(jìn)一步研究CeAGA神經(jīng)元對(duì)其他全身麻醉劑的反應(yīng)。注射K/X后，89.4%的CANEISO-GCaMP6m 神經(jīng)元的鈣信號(hào)增加。其中被激活的神經(jīng)元分為持續(xù)性激活神經(jīng)元和瞬時(shí)性激活神經(jīng)元。此外，在追蹤的160 個(gè)GCaMP6m陽(yáng)性神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)88.15%被異氟烷激活的神經(jīng)元也會(huì)被K/X 激活。以上結(jié)果強(qiáng)烈支持CeA 中存在可被異氟烷與K/X 共同激活的CeAGA神經(jīng)元集群。

（4）大多數(shù)CeAGA神經(jīng)元的活動(dòng)受到應(yīng)激的抑制

為了驗(yàn)證異氟烷或K/X 作用后CeAGA神經(jīng)元亞群的瞬時(shí)激活是否為應(yīng)激所致，對(duì)小鼠施加90 min束縛造成急性應(yīng)激，觀察到束縛導(dǎo)致基底外側(cè)杏仁核(BLA)中大量Fos 表達(dá)，但CeA 中較少。用CANE- tdTomato 標(biāo)記CeAGA神經(jīng)元后對(duì)同一小鼠再次施加90 min 束縛，發(fā)現(xiàn)只有12%±2%的CeAGA-tdTomato神經(jīng)元與Fos+神經(jīng)元共標(biāo)，27%±2%的Fos+神經(jīng)元與CeAGA-tdTomato 神經(jīng)元共標(biāo)。鈣成像和細(xì)胞示蹤技術(shù)也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)異氟烷激活的CeAGA神經(jīng)元卻被應(yīng)激抑制。

（5）對(duì)CeAGA神經(jīng)元的光遺傳操作不會(huì)誘發(fā)恐懼行為或改變大腦的總體狀態(tài)

(三)語(yǔ)義的規(guī)范性。語(yǔ)義的規(guī)范性主要是指在語(yǔ)言的發(fā)展過(guò)程中,其語(yǔ)義應(yīng)符合社會(huì)風(fēng)范、社會(huì)道德、詞語(yǔ)要健康文明等原則。網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)開(kāi)放的世界，人們隨心所欲, 因此為了表達(dá)暢快, 不惜用一些語(yǔ)義不健康, 不文明的詞語(yǔ), 如“我勒個(gè)去”、“靠”(一種不文明的罵人的話, 類似與“操”)等。這樣的詞雖使用起來(lái)簡(jiǎn)單、便利, 表達(dá)起來(lái)痛快, 但這是一種極不文明的言語(yǔ)行為。曹德和先生指出:“在現(xiàn)代漢語(yǔ)詞匯系統(tǒng)中, 除了‘不快語(yǔ)’以外, 還充斥著許多污言穢語(yǔ), 這些垃圾自然應(yīng)予清除。事實(shí)說(shuō)明, 倫理原則亦適用于語(yǔ)言的規(guī)范……”④ 據(jù)此, “我勒個(gè)去”、“靠”等一類污穢詞語(yǔ)將是不能進(jìn)入現(xiàn)代漢語(yǔ)詞匯系統(tǒng)中的。

異氟烷作用2 h 后，在CeAGA細(xì)胞中表達(dá)興奮性光敏感通道蛋白(CeAGA-ChR2)或抑制性光敏感通道蛋白(CeAGA-eArch)。結(jié)果顯示對(duì)CeAGA神經(jīng)元的光遺傳操作并沒(méi)有增加小鼠在曠場(chǎng)外圍區(qū)域或高價(jià)迷宮(EPM)閉合臂上停留的時(shí)間。額葉和頂葉皮層腦電圖(EEG)分析發(fā)現(xiàn)興奮CeAGA神經(jīng)元對(duì)EEG 功率譜沒(méi)有明顯影響，表明大腦總體狀態(tài)未發(fā)生明顯改變。

（6）光遺傳興奮或抑制CeAGA神經(jīng)元雙向且強(qiáng)力地調(diào)控小鼠疼痛行為

在無(wú)光刺激條件下，使用0.008～0.04 g 的vonFrey 作用于CeAGA-GFP（對(duì)照組）、CeAGA-ChR2 和CeAGA-eArch 三組小鼠兩側(cè)面部，均無(wú)反射性回避行為。至使用vonFrey 1.0 g 時(shí)，所有小鼠均出現(xiàn)反射性回避。當(dāng)光刺激CeAGA-ChR2 小鼠右側(cè)CeAGA，顯著減少了0.16～0.60 g 范圍內(nèi)同側(cè)和對(duì)側(cè)機(jī)械刺激下臉部反射性回避次數(shù)。而光抑制右側(cè)CeAGA細(xì)胞，小鼠對(duì)施加于面部的vonFrey 產(chǎn)生痛敏，其中同側(cè)尤為明顯。在輻射熱和冷痛測(cè)試中，也觀察到相同結(jié)果。綜上所述，通過(guò)多種軀體感覺(jué)測(cè)試，表明興奮和抑制CeAGA神經(jīng)元可雙向調(diào)節(jié)小鼠的痛覺(jué)行為，即興奮CeAGA緩解疼痛，而抑制CeAGA則產(chǎn)生痛敏。

（7）光遺傳興奮或抑制CeAGA神經(jīng)元雙向調(diào)控疼痛誘導(dǎo)的舔舐和擦拭等行為

將福爾馬林注射到CeAGA-GFP（對(duì)照組）、CeAGA-ChR2 和CeAGA-eArch 三組小鼠的后爪或須墊，小鼠表現(xiàn)為強(qiáng)烈的舔舐后爪和擦拭須墊等行為。ChR2 興奮CeAGA神經(jīng)元顯著降低福爾馬林I相并完全消除II 相的舔舐和擦拭行為。另外發(fā)現(xiàn)興奮CeAGA神經(jīng)元對(duì)交配行為沒(méi)有影響。因此，當(dāng)ChR2 興奮CeAGA神經(jīng)元時(shí)，舔舐和擦拭行為的減少不太可能是一般性動(dòng)機(jī)的抑制所導(dǎo)致。在II 相階段，光抑制CeAGA會(huì)立即引發(fā)小鼠強(qiáng)烈的舔爪行為。這表明抑制CeAGA神經(jīng)元，小鼠痛閾降低。

（8）CeAGA部分功能的偏側(cè)化

興奮CeAGA-ChR2 小鼠左側(cè)CeAGA，小鼠在vonFrey 實(shí)驗(yàn)中同側(cè)和對(duì)側(cè)的后肢回避次數(shù)均減少。令人驚訝的是面部vonFrey 測(cè)試中光激活左側(cè)CeAGA頭部回避反射無(wú)明顯改變。而冷痛、輻射熱以及后爪和面部福爾馬林實(shí)驗(yàn)中，興奮左側(cè)CeAGA細(xì)胞使小鼠回避反射潛伏期延長(zhǎng)，舔舐和擦拭行為顯著減少。表明除了面部vonFrey 測(cè)試有部分偏側(cè)化，興奮左側(cè)和右側(cè)CeAGA神經(jīng)元產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一樣的。

對(duì)CANEISO-GCaMP6m 標(biāo)記的CeAGA神經(jīng)元進(jìn)行在體鈣成像實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對(duì)自由活動(dòng)的小鼠進(jìn)行熱、冷和vonFrey 機(jī)械刺激。鈣成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CeAGA神經(jīng)元活性對(duì)各類傷害性刺激并沒(méi)有反應(yīng)。進(jìn)一步分析單一CeAGA神經(jīng)元的活動(dòng)變化發(fā)現(xiàn)多數(shù)神經(jīng)元的活動(dòng)水平在機(jī)體受到傷害性刺激時(shí)并不發(fā)生明顯變化。表明CeAGA神經(jīng)元的活性更多地表征小鼠的內(nèi)部狀態(tài)，而非外界傷害性刺激帶來(lái)的疼痛感覺(jué)。與成像結(jié)果一致的是CANE-GFP 標(biāo)記的CeAGA神經(jīng)元與福爾馬林激活的Fos+神經(jīng)元幾乎沒(méi)有共標(biāo)。

（10）無(wú)傷害性刺激的條件下抑制CeAGA神經(jīng)元誘發(fā)小鼠的厭惡感

在條件位置偏好(CPP)/厭惡(CPA)實(shí)驗(yàn)中，在CeAGA-ChR2 小鼠非偏愛(ài)側(cè)給予22 min 光刺激，在CeAGA-eArch 小鼠偏愛(ài)側(cè)給予持續(xù)10 min 光刺激。發(fā)現(xiàn)光激活CeAGA神經(jīng)元可引起小鼠的偏好性，而光抑制CeAGA神經(jīng)元會(huì)誘發(fā)小鼠的厭惡感。因此，在無(wú)傷害性刺激的條件下，抑制CeAGA神經(jīng)元可在小鼠中引起強(qiáng)烈的位置厭惡。

（11）激活CeAGA神經(jīng)元顯著減少慢性神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠的痛覺(jué)相關(guān)行為

將CeAGA-ChR2 小鼠面部右側(cè)眶下神經(jīng)(IoN)結(jié)扎制備慢性壓迫性損傷(CCI)模型。以正常不產(chǎn)生痛覺(jué)的0.02 gvonFrey 刺激CCI-IoN 小鼠面部，術(shù)側(cè)和非術(shù)側(cè)均產(chǎn)生反射性回避（鏡像痛）。值得注意的是，興奮術(shù)側(cè)CeAGA神經(jīng)元，小鼠反射性回避反應(yīng)顯著減少，大部分小鼠對(duì)1.0 g 刺激無(wú)反應(yīng)。表明神經(jīng)病理性疼痛中的機(jī)械性痛敏主要是由于異常的中樞處理導(dǎo)致的。

在條件位置偏好范式中，光激活小鼠的CeAGA神經(jīng)元，小鼠對(duì)光激活一側(cè)產(chǎn)生位置偏愛(ài)記憶，這可能是由于小鼠在該室中疼痛得到緩解。CCI-IoN 小鼠有自發(fā)地擦拭術(shù)側(cè)面頰部的行為，表明CCI-IoN 小鼠有自發(fā)性疼痛，而興奮CeAGA神經(jīng)元?jiǎng)t顯著減少CCI-IoN 小鼠總擦拭時(shí)間。綜上所述，興奮CeAGA可減少慢性神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠的痛相關(guān)行為。

（12）CeAGA神經(jīng)元廣泛投射到痛覺(jué)相關(guān)腦區(qū)并抑制其活動(dòng)

為了進(jìn)一步探究CeAGA神經(jīng)元如何發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，追蹤了CeAGA-GFP 小鼠CeAGA神經(jīng)元投射。CeAGA神經(jīng)元的下游腦區(qū)包括前額葉皮質(zhì)、伏隔核、背內(nèi)側(cè)紋狀體、島葉皮層、終紋床核、基底外側(cè)杏仁核、皮質(zhì)杏仁核、顳葉聯(lián)合皮質(zhì)、外嗅皮質(zhì)、內(nèi)嗅皮質(zhì)、丘腦下區(qū)域、丘腦板內(nèi)核、腹外側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、臂旁核、網(wǎng)狀核和孤束核。其中多數(shù)腦區(qū)參與痛覺(jué)軀體感覺(jué)或疼痛相關(guān)情緒的處理。值得注意的是，先前大多數(shù)研究都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CeA 直接投射到前額葉皮層，利用基于CeAGA神經(jīng)元的更精確的分子標(biāo)記的方法將可以進(jìn)一步地驗(yàn)證這個(gè)環(huán)路。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)NAc、紋狀體、Ins、BLA 和TeA/Ect 對(duì)側(cè)也有神經(jīng)支配，但與同側(cè)相比較為稀疏，這種雙側(cè)投射可以解釋單側(cè)激活CeAGA的雙側(cè)效應(yīng)。此外，許多CeAGA神經(jīng)元軸突投射到福爾馬林誘導(dǎo)的Fos+神經(jīng)元?？紤]到CeAGA神經(jīng)元是GABA 能神經(jīng)元，因此，理論上這些神經(jīng)元投射可以抑制痛激活神經(jīng)元的活動(dòng)。實(shí)際上，光激活CeAGA-ChR2 小鼠雙側(cè)CeAGA顯示CeAGA靶區(qū)Fos+神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，表明CeAGA神經(jīng)元可以抑制多數(shù)痛覺(jué)相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元激活。

（13）低劑量氯胺酮的鎮(zhèn)痛效應(yīng)需要CeAGA神經(jīng)元的本底活性

鈣成像顯示相較于1.5%異氟烷，在0.5%異氟烷作用下CANEISO-GCaMP6m 標(biāo)記的神經(jīng)元更多。本文作者使用臨床上具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)的低劑量氯胺酮，追蹤了69 個(gè)CANEISO-GCaMP6m 標(biāo)記的CeAGA神經(jīng)元在三種條件下的成像—1.5%異氟烷、常規(guī)劑量氯胺酮(100 mg·kg-1)和低劑量氯胺酮(12 mg·kg-1)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)元在三種條件下都被激活。為了驗(yàn)證低劑量氯胺酮鎮(zhèn)痛是否需要CeAGA神經(jīng)元的本底活性，將辣椒素(2 μg/10 μl)注射到CeAGA-eArch小鼠后爪誘發(fā)舔爪行為，低劑量氯胺酮顯著縮短舔舐的總時(shí)長(zhǎng)。抑制CeAGA神經(jīng)元時(shí)，氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用被消除，表明低劑量氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用需要CeAGA神經(jīng)元的本底活性。

4.討論

中樞鎮(zhèn)痛系統(tǒng)最初是根據(jù)二戰(zhàn)期間在美國(guó)陸軍服役的醫(yī)生 H.K.Beecher發(fā)表的一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性研究提出的，研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重受傷的士兵雖然有意識(shí)，但并未感知到疼痛。這隨后引發(fā)了人們對(duì)中樞鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的研究興趣。此外，臨床發(fā)現(xiàn)安慰劑有鎮(zhèn)痛作用，也表明存在中樞鎮(zhèn)痛，但背后具體機(jī)制尚不清楚。過(guò)去研究的主要進(jìn)展是在中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)的腦-脊髓下行疼痛調(diào)節(jié)通路方面；但前腦是否存在中樞鎮(zhèn)痛中心以及其具體機(jī)制尚不清楚。本研究假設(shè)GA 誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛是一個(gè)積極的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)CeAGA神經(jīng)元作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，可以被GA 激活，抑制疼痛反應(yīng)，且廣泛投射到痛覺(jué)相關(guān)腦區(qū)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

有趣的是，之前認(rèn)為CeA 是應(yīng)激和安慰劑誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，并且大鼠CeA 損傷后，鎮(zhèn)痛效應(yīng)消失，然而尚不清楚CeA 神經(jīng)元的哪些亞群參與鎮(zhèn)痛。目前同樣不清楚的是，應(yīng)激和安慰劑是否是由相同的CeA 神經(jīng)元發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。我們知道應(yīng)激可以增強(qiáng)或減輕疼痛，具體取決于環(huán)境。在本研究中，大多數(shù)CeAGA神經(jīng)元被束縛應(yīng)激抑制，這表明CeAGA可能不參與應(yīng)激引發(fā)的鎮(zhèn)痛(SIA)。此外，激活CeAGA神經(jīng)元對(duì)恐懼或焦慮樣行為沒(méi)有影響，而SIA 通常由恐懼引起。因此參與恐懼反應(yīng)的CeA 神經(jīng)元更有可能參與SIA。同樣地，表達(dá)Sst 的CeA神經(jīng)元已知可介導(dǎo)恐懼誘發(fā)的僵住不動(dòng)的反應(yīng)并減少疼痛，但這些神經(jīng)元與本研究CeAGA神經(jīng)元沒(méi)有共標(biāo)。然而，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)激還是激活了少量CeAGA神經(jīng)元。因此，不能排除強(qiáng)烈的應(yīng)激源，可能會(huì)激活更多的CeAGA神經(jīng)元產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。此外，本文作者認(rèn)為接下來(lái)探究CeAGA是否參與安慰劑鎮(zhèn)痛也很有意義。

本研究中分子標(biāo)記和鈣成像實(shí)驗(yàn)都表明，CeAGA神經(jīng)元是一個(gè)異質(zhì)性神經(jīng)元集群。本文作者發(fā)現(xiàn)CeAGA神經(jīng)元不表達(dá)Sst、Pdyn 和Nts；然而部分CeAGA神經(jīng)元表達(dá)Penk1 或Pkc-d。興奮位于CeA囊狀區(qū)的Pkc-d+神經(jīng)元參與處理有害和其他厭惡性信息，并引發(fā)防御行為，而興奮位于CeA 外側(cè)的Pkc-d+神經(jīng)元?jiǎng)t減少防御行為，并減少積極狀態(tài)下的攝食，激活表達(dá)Pkc-d 的CeAGA神經(jīng)元可以抑制疼痛反應(yīng)。未來(lái)的研究需要找到更多的標(biāo)記分離鎮(zhèn)痛和致痛的Pkc-d+細(xì)胞。盡管可能是CeAGA神經(jīng)元的一個(gè)特定集群發(fā)揮大部分的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但也可能是由Fos+所標(biāo)記的整個(gè)CeAGA神經(jīng)元的異質(zhì)集合協(xié)同作用來(lái)抑制疼痛。本研究觀察到許多疼痛激活的區(qū)域都有CeAGA神經(jīng)元的投射。不同的CeAGA集群很可能只支配一部分疼痛處理中心，而CeAGA神經(jīng)元的整個(gè)集合需要完成全部的鎮(zhèn)痛功能。

本研究還發(fā)現(xiàn)在小鼠慢性頭面部神經(jīng)病理性疼痛模型中，神經(jīng)損傷會(huì)導(dǎo)致機(jī)械痛敏，而興奮CeAGA神經(jīng)元，術(shù)側(cè)對(duì)1.0 gvonFrey 的反應(yīng)降低（即低敏感），這與結(jié)扎損傷神經(jīng)，降低周圍神經(jīng)末梢感受機(jī)械性刺激能力的報(bào)道是一致的。這表明，神經(jīng)病理性疼痛引發(fā)的觸覺(jué)超敏，很可能是由于剩余無(wú)損傷的感覺(jué)纖維傳遞的信號(hào)在中樞處理時(shí)發(fā)生改變，而激活CeAGA神經(jīng)元可以抑制這種異常的中樞加工。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，所有的CeAGA靶區(qū)都含有被疼痛刺激強(qiáng)烈激活的神經(jīng)元，而且值得注意的是，所有這些疼痛誘發(fā)的活動(dòng)都可以被光激活的CeAGA抑制。有趣的是，CeAGA神經(jīng)元并沒(méi)有投射到丘腦感覺(jué)核團(tuán)，或初級(jí)/次級(jí)感覺(jué)皮層，表明這些神經(jīng)元可能有分離痛覺(jué)和一般感覺(jué)的功能，這與小劑量氯胺酮對(duì)病人的作用效果是相同的。

目前，全身麻醉是如何激活CeAGA神經(jīng)元的尚不清楚，另外持續(xù)性激活CeAGA神經(jīng)元是否會(huì)成癮也不清楚。但本研究提出了利用這種內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)來(lái)緩解慢性疼痛的可能性。下一步將篩選可以特異性激活這些強(qiáng)效鎮(zhèn)痛神經(jīng)元的小分子化合物，從而取代全身麻醉藥物，發(fā)展新一代的鎮(zhèn)痛藥。