一種新型貝殼基質(zhì)蛋白的重組表達(dá)與功能分析

孫琦，姜雨婷，徐煥志，申望，張曉林，范美華，廖智

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

貝殼是一類天然的具有納米結(jié)構(gòu)層次的生物礦化材料，其鈣化層中，無機(jī)成分超過95%，主要為碳酸鈣晶體，有機(jī)質(zhì)成分含量較低，通常在5%以下［1］。其中，蛋白質(zhì)是有機(jī)成分的主體，被稱為貝殼基質(zhì)蛋白（shell matrix protein，SMP）。自然界中碳酸鈣晶體主要包括三種晶型，分別是方解石型（calcite）、文石型（aragonite）和球霰石型（vaterite）［2］。軟體動物貝殼中的碳酸鈣晶體主要有熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的方解石型和文石型兩種，其中天然方解石型晶體多為規(guī)則立方體，而文石型晶體的形貌則取決于誘導(dǎo)條件，情況較為復(fù)雜［3］。貝殼生物礦化一般發(fā)生在有機(jī)-無機(jī)界面，碳酸鈣晶體的形成與沉積，包括成核、生長、晶型以及形貌形成等受SMP 調(diào)控［4］；此外，貝殼中由幾丁質(zhì)等非蛋白質(zhì)成分構(gòu)成的有機(jī)框架的形成也受SMP 調(diào)控［5］?？梢?，SMP 在貝殼的形成以及力學(xué)性能賦予方面具有重要作用。SMP 根據(jù)其在醋酸溶液或EDTA 溶液中的溶解性分為可溶性蛋白和不溶性蛋白兩大類，其中不溶性SMP 和幾丁質(zhì)等共同參與貝殼中疏水性有機(jī)框架的搭建［6］；而可溶性SMP 則主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)碳酸鈣晶體的成核并調(diào)控其生長［7］。目前已報(bào)道的多數(shù)SMP 富含某一種或某幾種氨基酸殘基，例如富含酸性氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）的SMP 已被證實(shí)與生物礦化密切相關(guān)［8］；而側(cè)鏈較小的氨基酸殘基，包括甘氨酸和丙氨酸等，在部分SMP 序列中的高度聚集分布也被認(rèn)為與SMP 形成模塊化結(jié)構(gòu)有關(guān)，并對生物礦化有重要影響［9］。

厚殼貽貝（Mytilus coruscus）貝殼主要由珍珠質(zhì)層、肌棱柱層和纖維棱柱層構(gòu)成［10］。此前已有研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)策略從厚殼貽貝貝殼中鑒定到超過60 種SMP 成分，包括碳酸酐酶、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、絲蛋白、酪氨酸酶、蛋白酶抑制劑等［11］。其中，一種富含谷氨酰胺的貝殼蛋白（Glutamine-rich shell protein，GRSP）在厚殼貽貝貝殼肌棱柱層中被鑒定到［11］，但其在生物礦化過程中的作用及其分子機(jī)理目前尚不清楚。厚殼貽貝GRSP 序列中含有一個PDZ （postsynaptic density/discs large/zonula occludens）結(jié)構(gòu)域和一個ZM（ZASP-like motif）結(jié)構(gòu)域，已知含這兩種結(jié)構(gòu)域的蛋白在生物體內(nèi)分布廣泛，被認(rèn)為是參與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域［12］。為探究GRSP 在貝殼形成過程中可能發(fā)揮的作用，筆者對厚殼貽貝貝殼的GRSP 進(jìn)行了序列分析，對原核重組表達(dá)以及重組GRSP 的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，重組厚殼貽貝GRSP 對碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度、晶體形貌和晶型均有影響，由此推測GRSP 與貝殼的形成及發(fā)育具有重要關(guān)聯(lián)。上述研究為進(jìn)一步探討GRSP 在厚殼貽貝貝殼形成過程中的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，也為GRSP 的后續(xù)蛋白質(zhì)工程改造提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝GRSP 的序列分析

厚殼貽貝GRSP 的基因序列已入GenBank 數(shù)據(jù)庫，編號為AKS48171.1，通過生物信息學(xué)手段開展蛋白序列分析。其中，用Lasergene 軟件（版本7.0）確定開放閱讀框；用DNAman 軟件進(jìn)行序列比對；通過Expasy 數(shù)據(jù)庫的protparam 軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）在線進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析；在NCBI 網(wǎng)站上利用BLAST 軟件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線進(jìn)行同源序列搜索；在MEGA 軟件（版本5.1）上進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化樹分析；用SMART 軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；用Signal P 5.0 軟 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/））在線進(jìn)行信號肽預(yù)測；用Phyre2軟件（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）在線進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；通過SWISS MODEL 服務(wù)器（https：//swissmodel.expasy.org/）在線進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2 GRSP 的密碼子優(yōu)化與表達(dá)載體的構(gòu)建

為獲得適合大腸桿菌表達(dá)體系的目標(biāo)基因，對厚殼貽貝GRSP 的cDNA 成熟肽編碼的基因序列（1 788 bp）進(jìn)行大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化。在目標(biāo)基因5' 端添加NcoI 限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)（CCATGG）和多聚組氨酸標(biāo)簽；3'端添加終止密碼子（TAA）和XhoI 酶切位點(diǎn)（CTCGAG）；最終設(shè)計(jì)出的目標(biāo)基因全長1 817 bp。該目標(biāo)基因由南京金斯瑞公司合成。合成后對PDZ 序列進(jìn)行測序驗(yàn)證。表達(dá)載體采用Pet28α（+）質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后，用T4-DNA 連接酶將目標(biāo)基因序列與表達(dá)質(zhì)粒酶切片段連接，連接產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的重組菌涂布于含氨芐青霉素的LB 平板，經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR 鑒定，將陽性克隆結(jié)果送至上海生工生物公司進(jìn)一步測序驗(yàn)證。

1.3 重組厚殼貽貝GRSP 的表達(dá)、純化及鑒定

參照文獻(xiàn)［13］中的方法開展重組厚殼貽貝GRSP 的原核重組表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物采用Ni-NTA 親和層析柱純化。目標(biāo)蛋白經(jīng)鎳柱分離純化后，參照文獻(xiàn)［14］中的方法進(jìn)行透析復(fù)性處理。對復(fù)性后的目標(biāo)蛋白進(jìn)一步采用反相高效液相質(zhì)譜（Waters 600 E 型，美國沃特世公司）進(jìn)行脫鹽和純化。檢測器為Waters 2487 雙波長紫外檢測器（美國沃特世公司）；色譜柱為 C4 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，300 ?，安捷倫）；采用二元線性梯度洗脫，其中A 液為含0.1% 三氟乙酸的純水，B 液為含0.1%三氟乙酸的乙腈；B 液在35 min 內(nèi)，其比例由30% 升 至70%；流速為1 mL·min-1；檢測波長為280 nm。收集目標(biāo)洗脫峰，經(jīng)冷凍干燥后備用。

SDS-PAGE 采用12%分離膠，以及120 V 恒壓模式，結(jié)束后用醋酸液固定20 min，以考馬斯亮藍(lán)G250 染料染色后拍照觀察。

1.4 重組厚殼貽貝GRSP 的功能分析

重組厚殼貽貝GRSP 的功能分析主要包括碳酸鈣晶體形貌分析、晶體晶型分析、結(jié)晶速度分析以及晶體結(jié)合分析。采用體外碳酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)法［15］分析碳酸鈣晶體形貌，其中，在制備方解石型碳酸鈣晶體時(shí)，將CaCl2溶液置于事先放置（NH4）2CO3固體的玻璃干燥皿內(nèi)進(jìn)行結(jié)晶，利用（NH4）2CO3揮發(fā)出的CO2與CaCl2溶液反應(yīng)獲得方解石型碳酸鈣晶體；在上述方法基礎(chǔ)上，預(yù)先在CaCl2溶液中按物質(zhì)的量之比為1∶4 添加MgCl2溶液，在Mg2+誘導(dǎo)下，CaCl2與CO2反應(yīng)形成文石型碳酸鈣晶體［16］。在上述反應(yīng)體系中，加入重組GRSP 蛋白溶液，蛋白溶液終濃度分別為0，10，30 和50 μg·mL-1。在重組GRSP 誘導(dǎo)下形成的碳酸鈣晶體經(jīng)真空噴金處理，以場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Nova nano SEM 450，美國FEI 公司）觀察晶體形貌。掃描電鏡采用二次電子模式收集信號，加速電壓為5 kV，束斑直徑為3.0 mm，工作距離為6.0～7.0 mm。

采用傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）并參照文獻(xiàn)［13］中的方法進(jìn)行碳酸鈣晶體的晶型分析。采用Nicolet Nexus 670 紅外光譜儀（美國熱電公司）以透射模式測量上述步驟中經(jīng)50 μg·mL-1重組GRSP 誘 導(dǎo)下形成 的碳酸鈣 晶體。掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1。采用Omnic 軟件（版本8.2.387）對紅外譜圖進(jìn)行分析處理。

參照文獻(xiàn)［13］中的方法進(jìn)行碳酸鈣結(jié)晶速度抑制。在CaCl2溶液中加入不同濃度的重組厚殼貽貝GRSP，利用（NH4）2CO3固體所揮發(fā)的CO2與CaCl2溶液反應(yīng)形成碳酸鈣晶體。上述反應(yīng)在96 孔板中進(jìn)行，用酶標(biāo)儀（Biotec H1，美國博騰公司）在600 nm 波長處進(jìn)行掃描，觀察碳酸鈣晶體形成過程中溶液濁度的變化。

參照文獻(xiàn)［13］中的方法進(jìn)行重組厚殼貽貝GRSP 與碳酸鈣晶體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。事先配置0.5 mg·mL-1重組GRSP 溶液（溶液A），加入碳酸鈣晶體粉末，震蕩混勻后室溫孵育2 h，離心（8 000 r·min-1，15 min）后取上清（溶液B）備用；經(jīng)去離子水洗滌后用5%醋酸溶液溶解沉淀物，脫鈣、離心、透析后，獲得溶液C。對溶液A，B，C 分別進(jìn)行SDSPAGE 電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝GRSP 是一種含PDZ 結(jié)構(gòu)域的新型貝殼基質(zhì)蛋白

厚殼貽貝GRSP 基因的開放閱讀框全長1 788 bp，可編碼由595 個氨基酸殘基組成的前體蛋白，其理論分子質(zhì)量為67.7 kDa，等電點(diǎn)pI 為9.37，是一種堿性蛋白。其核苷酸-氨基酸序列比對如圖1 所示。氨基酸組成分析結(jié)果表明，厚殼貽貝GRSP 序列中含量最豐富的氨基酸為谷氨酰胺（Gln，18.2%），其次分別 為脯氨 酸（Pro，13.6%）和絲氨 酸（Ser，7.2%）。同源蛋白搜索結(jié)果表明，厚殼貽貝GRSP 在數(shù)據(jù)庫中缺少高同源性蛋白。排除未知蛋白和假設(shè)蛋白后，數(shù)據(jù)庫中僅有55 條同源序列的E值＜1.0 e-05。其中，得分最高的為來自蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）的一種PDLIM3（PDZ and LIM domain 3）蛋白，序列一致性僅為38.33%。在同源序列搜索結(jié)果中，選取22 條代表性序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，厚殼貽貝GRSP 的進(jìn)化地位較為特殊，其進(jìn)化支介于扇貝科和牡蠣科且獨(dú)立成支，表明在進(jìn)化上，厚殼貽貝GRSP 與其他雙殼貝類的同源蛋白存在較大差異。

圖3 為厚殼貽貝GRSP 的結(jié)構(gòu)域與來自軟體動物的同源蛋白的結(jié)構(gòu)域比較，由圖3 可知，厚殼貽貝GRSP 序列中無信號肽，含有一個PDZ 結(jié)構(gòu)域和一個ZM 結(jié)構(gòu)域（分別為肽段20～92 和497～522）。進(jìn)一步比較結(jié)構(gòu)域類似的GRSP 與來自軟體動物的同源蛋白發(fā)現(xiàn)，在軟體動物中，含有PDZ 和ZM 結(jié)構(gòu)域的GRSP 同源蛋白，根據(jù)其序列長度和結(jié)構(gòu)與分布可分為4 類，其中，第I 類為包括厚殼貽貝GRSP 在內(nèi)的含PDZ 和ZM 結(jié)構(gòu)域的中等序列同源蛋白（序列長度為500～800 氨基酸殘基）；第II 類為含PDZ，ZM 和LIM 結(jié)構(gòu)域的同源蛋白；第III 類為含PDZ 和ZM 結(jié)構(gòu)域的短序列同源蛋白（序列長度在400 氨基酸殘基內(nèi)）；第IV 類為含PDZ 和ZM 結(jié)構(gòu)域的長序列同源蛋白（序列長度在1 000 氨基酸殘基以上）。厚殼貽貝GRSP 在序列長度以及結(jié)構(gòu)域架構(gòu)上與來自蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）的PDLIM3 蛋白，以及來自加州海兔（Aplysia californica）的trithorax 蛋白和pollen-specific leucine-rich repeat extensin-like 蛋白相似，可歸為第I 類。

圖1 厚殼貽貝GRSP 的cDNA 序列與開放閱讀框推導(dǎo)的氨基酸序列比對Fig.1 The molecular sequence of Mytilus coruscus GRSP and the sequential alignment of amino acid sequence derived from its open reading frame

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，厚殼貽貝GRSP 序列中，α-螺旋占18%，β-折疊占8%，且多數(shù)分布于序列N 端，少數(shù)分布于序列C 端；此外，無規(guī)卷曲占78%，為優(yōu)勢構(gòu)象，如圖4（a）所示。經(jīng)SWISS MODEL 服務(wù)器通過同源建模方式進(jìn)一步預(yù)測GRSP 的三級結(jié)構(gòu)。在序列比對的基礎(chǔ)上，分別以RCSB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中得分最高的1v5l.1.A，2uzc.5.A，2q3g.1.A 為模板（3 種模板蛋白均為PDLIM 蛋白），構(gòu)建結(jié)構(gòu)模型，3 種結(jié)構(gòu)模型基本一致，如圖4（b）所示。厚殼貽貝GRSP 的三級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊以及無規(guī)卷曲，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.2 用密碼子優(yōu)化策略成功表達(dá)重組GRSP

厚殼貽貝GRSP 基因序列長度為1 788 bp，經(jīng)密碼子優(yōu)化和序列重新設(shè)計(jì)后，目標(biāo)基因序列長度為1 817 bp；目標(biāo)基因與pET28 表達(dá)質(zhì)粒連接，其重組表達(dá)產(chǎn)物的理論分子質(zhì)量約為80 kD，含目標(biāo)基因序列和表達(dá)質(zhì)粒的部分載體序列，包括多聚組氨酸標(biāo)簽。對優(yōu)化前后的目標(biāo)基因開展密碼子優(yōu)化指數(shù)（codon adaptation index，CAI）分析，結(jié)果見圖5。經(jīng)OptimumGeneTM 軟件計(jì)算，優(yōu)化前，GRSP 基因的CAI 為0.59；優(yōu)化后，GRSP 基因的CAI 達(dá)0.87，大于0.80，意味著該目標(biāo)基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率較高［17］。

2.3 用pET28a/BL21（DE3）體系成功表達(dá)重組GRSP

重組GRSP 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，以SDSPAGE 驗(yàn)證表達(dá)效果，結(jié)果見圖6。表達(dá)菌株經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，出現(xiàn)明顯的目標(biāo)蛋白條帶，其分子質(zhì)量約為80 kD，比預(yù)期高約10 kD，如圖6（a）所示；采用抗多聚組氨酸標(biāo)簽的抗體通過western blot進(jìn)一步分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明，目標(biāo)條帶含有多聚組氨酸標(biāo)簽，且分子質(zhì)量也約為80 kD，表明表達(dá)產(chǎn)物正確，如圖6（b）所示。在SDS-PAGE 中，由于蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，遷移率出現(xiàn)異常，導(dǎo)致表觀分子質(zhì)量與其實(shí)際分子質(zhì)量產(chǎn)生差異［18］，又由于GRSP 序列中含有高豐度的谷氨酰胺，且GRSP 是一種堿性蛋白，推測GRSP 在電泳中遷移率偏低，導(dǎo)致分子質(zhì)量偏大。重組GRSP 的目標(biāo)條帶，在低溫誘導(dǎo)下表達(dá)量極低；而在37 ℃條件下表達(dá)量較高，且均在上清和沉淀中表達(dá)，但在沉淀中表達(dá)量較大，表明重組GRSP 的原核重組表達(dá)形式主要為包涵體。重組蛋白的鎳柱分離結(jié)果表明，重組蛋白可在300 mmol·L-1咪唑濃度下得到充分洗脫，如圖6（c）所示。

重組GRSP 經(jīng)鎳柱純化和透析復(fù)性后，進(jìn)一步用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，結(jié)果如圖7 所示，收集在45%乙腈濃度時(shí)被洗脫的主峰，即為純化的重組GRSP。

2.4 重組GRSP 可誘導(dǎo)碳酸鈣晶體形貌的變化

圖2 采用臨近法繪制的厚殼貽貝GRSP 與22 條代表性同源序列進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of Mytilus coruscus GRSP with 22 homologous sequences using the Neighbor-joining approach

圖3 厚殼貽貝GRSP 的結(jié)構(gòu)域與來自軟體動物的同源蛋白結(jié)構(gòu)域的比較Fig.3 Domain comparison of the Mytilus coruscus GRSP with the homologues from other mollusks

圖4 厚殼貽貝GRSP 的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 The structural features of Mytilus coruscus GRSP

圖5 優(yōu)化前后厚殼貽貝GRSP 基因序列的密碼子優(yōu)化指數(shù)分布Fig.5 The CAI distribution of the gene sequence of Mytilus coruscus GRSP before and after the optimization

重組GRSP 對碳酸鈣晶體體外結(jié)晶的誘導(dǎo)結(jié)果見圖8 和圖9。天然方解石型碳酸鈣晶體形貌為規(guī)則的六面體形態(tài)，如圖8（a）所示；作為對照組，當(dāng)牛血清白蛋白（BSA）濃度為50 μg·mL-1時(shí)，對方解石型碳酸鈣的結(jié)晶無明顯影響，如圖8（b）所示；在低濃度（10 μg·mL-1）和中等濃度（30 μg·mL-1）重組GRSP 誘導(dǎo)下，方解石型碳酸鈣晶體形貌均無明顯變化，如圖8（c）和（d）所示；但在高濃度（50 μg·mL-1）重組GRSP誘導(dǎo)下，部分碳酸鈣晶體出現(xiàn)疊合，如圖8（e）和（f）所示，表明高濃度重組GRSP 對方解石型碳酸鈣的結(jié)晶有微弱誘導(dǎo)作用。由圖9（a）和（b）可知，天然文石型碳酸鈣晶體形貌與其在BSA 作用下無明顯區(qū)別，均為球狀結(jié)構(gòu)；而在加入不同濃度的重組GRSP 后，文石型碳酸鈣晶體形貌出現(xiàn)了明顯變化。其中，加入低濃度（10 μg·mL-1）重組GRSP 后，部分碳酸鈣晶體發(fā)生輕微分裂，如圖9（c）所示；加入30 μg·mL-1重組GRSP 后，大部分碳酸鈣晶體發(fā)生較強(qiáng)分裂并出現(xiàn)葡萄狀晶體構(gòu)造；加入50 μg·mL-1重組GRSP 后，碳酸鈣晶體形貌進(jìn)一步變?yōu)椴灰?guī)則的花瓣?duì)罹w構(gòu)造，如圖9（e）和（f）所示。

圖6 重組GRSP 表達(dá)后的SDS-PAGE 和western blot 分析Fig.6 SDS-PAGE and western blot analyses of recombinant expressed of GRSP

圖7 重組GRSP 復(fù)性后經(jīng)HPLC 純化和SDS-PAGE 分析Fig.7 HPLC purification and SDS-PAGE analysis of renaturated recombinant GRSP

圖8 方解石型碳酸鈣晶體在不同濃度重組GRSP 誘導(dǎo)下的SEM 結(jié)果Fig.8 SEM images of in vitro crystallization of calcite calcium carbonate in the presence of recombinant GRSP with different concentration

圖9 文石型碳酸鈣晶體在不同濃度重組GRSP 誘導(dǎo)下的SEM 結(jié)果Fig.9 SEM images of in vitro crystallization of aragonite calcium carbonate in the presence of recombinant GRSP with different concentration

采用傅里葉紅外光譜（FTIR）分析重組GRSP對碳酸鈣晶體晶型的影響，結(jié)果見圖10。由圖10（a）可知，重組GRSP（50 μg·mL-1）對方解石型碳酸鈣晶體晶型的影響較明顯，比對照組多2 個峰，即波數(shù)為1 087.72 和745.10 的峰，均為文石型碳酸鈣晶體的特征峰［19］；而重組GRSP 對文石型碳酸鈣晶體晶型無明顯影響，見圖10（b）。

2.5 重組GRSP 對方解石型碳酸鈣晶體結(jié)晶速度具有抑制作用

圖10 傅里葉紅外光譜分析圖Fig.10 FTIR spectra of the crystals collected from the crystallization experiments

用分光光度計(jì)法測定碳酸鈣晶體結(jié)晶的時(shí)間，記錄在重組GRSP 影響下碳酸鈣晶體結(jié)晶速度變化。結(jié)果表明，重組GRSP 對方解石型碳酸鈣晶體結(jié)晶速度有明顯的抑制作用（P＜0.01），且在高濃度（50 μg·mL-1）條件下抑制作用較強(qiáng)，如圖11（a）所示。但重組GRSP 對文石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度具有一定促進(jìn)作用，低濃度時(shí)表現(xiàn)為輕微促進(jìn)，高濃度時(shí)（50 μg·mL-1）表現(xiàn)為明顯促進(jìn)（P＜0.05），如圖11（b）所示。

圖11 在重組GRSP 下碳酸鈣晶體結(jié)晶速度變化Fig.11 Rate change of CaCO3 crystallization rate by recombinant GRSP

2.6 重組GRSP 具有與碳酸鈣晶體結(jié)合的作用

重組GRSP 具有與碳酸鈣晶體結(jié)合的作用，由圖12可知，重組GRSP 與方解石型以及文石型碳酸鈣晶體均有明顯的結(jié)合作用，經(jīng)與碳酸鈣晶體孵育并離心，其上清液中蛋白條帶明顯變?nèi)?，進(jìn)一步將已結(jié)合重組GRSP的碳酸鈣晶體經(jīng)醋酸脫鈣，重組GRSP被釋放，在SDS-PAGE電泳中重新出現(xiàn)目標(biāo)條帶。

圖12 重組GRSP 與方解石型以及文石型碳酸鈣晶體結(jié)合后的SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.12 In vitro adsorption of recombinant GRSP precipitated by CaCO3（calcite and aragonite）crystal

3 討論

生物礦化是動物硬組織，包括貝類貝殼（碳酸鈣）和脊椎動物骨骼（羥基磷灰石）等形成的主要機(jī)制，其過程受各種生物礦化蛋白的調(diào)控［20］。其中，貝類的貝殼基質(zhì)蛋白在貝殼形成過程中對碳酸鈣晶體有重要的調(diào)控作用。從蛋白質(zhì)組學(xué)分析看，從一個物種中鑒定出的貝殼基質(zhì)蛋白種類有數(shù)十種至數(shù)百種不等［11，21-23］，這一方面與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)及相關(guān)儀器的靈敏度有關(guān)，另一方面也表明不同物種的貝殼，因其結(jié)構(gòu)差異，在貝殼基質(zhì)蛋白的分子組成上存在較大差異，同時(shí)也表明貝殼在形成時(shí)所涉及的分子機(jī)理極為復(fù)雜。目前，SMP 如何調(diào)控貝殼形成仍缺乏足夠的依據(jù)，雖然數(shù)據(jù)庫中已有上千種不同物種的貝殼基質(zhì)蛋白序列，但其對碳酸鈣晶體結(jié)晶的影響以及在貝殼形成中的作用機(jī)制仍了解不多。

作為一種含PDZ 結(jié)構(gòu)域的貝殼基質(zhì)蛋白，GRSP 已在雙殼貝類貝殼，如貽貝、牡蠣、扇貝等中被檢出［11，21，24-25］，表 明GRSP 可能是 一種普 遍存在于雙殼貝類的貝殼基質(zhì)蛋白。GRSP 無可預(yù)測的信號肽，表明該蛋白是一種胞內(nèi)蛋白，但其通過何種途徑運(yùn)輸至貝殼內(nèi)部尚不得而知。但從以往的研究看，在所鑒定的貝殼基質(zhì)蛋白中，帶有信號肽序列的蛋白所占比例并不高，通常不到20%［11，21］。從現(xiàn)有研究看，貝殼基質(zhì)蛋白分泌至貝殼具有多種轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，經(jīng)典的信號肽轉(zhuǎn)運(yùn)途徑只是其中之一，還有囊泡運(yùn)輸?shù)龋?6-27］。因此，盡管GRSP 序列中無信號肽，但仍有可能通過其他途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)至貝殼內(nèi)。GRSP 的氨基酸序列分析結(jié)果表明，GRSP 富含谷氨酰胺、脯氨酸和絲氨酸，其中谷氨酰胺的比例高達(dá)18.2%，此外，在序列部分區(qū)域形成“QQQP/YQ”重復(fù)序列且集中分布在其序列PDZ結(jié)構(gòu)域和ZM 結(jié)構(gòu)域之間（見圖1）。上述低復(fù)雜度區(qū)域以及高豐度的谷氨酰胺殘基可能與GRSP 的功能密切相關(guān)。貝殼基質(zhì)蛋白通常富含某一種或某幾種氨基酸，例如，從珠母貝（Pinctada fucata）貝殼中檢測到的貝殼基質(zhì)蛋白N16 富含甘氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，阿司匹林（Aspein）富含天冬氨酸［28-29］，以及從三角帆蚌（Pinna nobilis）貝殼中檢測到的黏蛋白（mucoperlin）富含絲氨酸和脯氨酸等［30］。高豐度的某種氨基酸往往會在序列中形成所謂的低復(fù)雜度區(qū)域（low complexity region）或重復(fù)片段。該區(qū)域因其結(jié)構(gòu)柔性較大，而被認(rèn)為有利于貝殼基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及有利于與多種靶標(biāo)分子（如鈣離子或者碳酸鈣晶體）結(jié)合［31-34］；另外，低復(fù)雜度區(qū)域以及重復(fù)片段被認(rèn)為具備較好的進(jìn)化靈活性，有利于貝殼基質(zhì)蛋白的分子進(jìn)化［35-36］。GRSP 在序列的185～286 肽段以及570～581 肽段，形成富含谷氨酰胺殘基的低復(fù)雜度區(qū)域（見圖1），推測該區(qū)域可能與其分子結(jié)構(gòu)的柔性以及生物礦化功能有重要聯(lián)系。

GRSP 序列中含有PDZ 結(jié)構(gòu)域和ZM 結(jié)構(gòu)域，并與PDLIM 蛋白具有一定的同源性。PDZ 結(jié)構(gòu)域普遍存在于生物中，是一種涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域［37-38］，該結(jié)構(gòu)域參與了多種蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，如膜相關(guān)蛋白、胞質(zhì)信號蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等［12，37-39］。而ZM 結(jié)構(gòu)域較為短?。ú怀^30 個氨基酸殘基），且通常伴隨PDZ 結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞骨架蛋白和肌肉蛋白中，作為一種Z帶選擇性剪切PDZ 結(jié)構(gòu)域（Z-band alternatively spliced PDZ motif，ZASP）存在［39］。PDLIM 蛋白是一種典型的含PDZ 結(jié)構(gòu)域和ZM 結(jié)構(gòu)域的蛋白，也是一種模塊化的涉及蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)［40］，其在進(jìn)化過程中具有高度保守性，并在器官發(fā)育和維持以及組織形態(tài)發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用［41］，PDLIM 蛋白具有多種功能，包括與肌動蛋白的結(jié)合，參與細(xì)胞骨架調(diào)控等［40-43］，此外，其還與生物礦化存在關(guān)聯(lián)，可調(diào)控骨組織發(fā)育過程中骨骼的形成、分化和成熟［44］。考慮GRSP 與PDLIM 蛋白存在一定的序列相似性和結(jié)構(gòu)域架構(gòu)相似性（見圖3），推測GRSP 可能對貝殼的形成有影響，通過蛋白序列中的PDZ/ZM 結(jié)構(gòu)域與其他貝殼基質(zhì)蛋白的相互作用調(diào)控貝殼形成。

重組厚殼貽貝GRSP 的功能分析結(jié)果表明，重組GRSP 對碳酸鈣晶體的形貌和晶型影響較大，主要表現(xiàn)為文石型碳酸鈣晶體的形貌發(fā)生改變（見圖9）以及方解石型晶體的晶型出現(xiàn)文石型特征峰（見圖10）。厚殼貽貝GRSP 主要鑒定自貝殼中的肌棱柱層［11］。肌棱柱層是貝殼負(fù)責(zé)與后閉殼肌相連的區(qū)域，其碳酸鈣晶體主要為平行排列的文石型晶體，與同樣是文石型的珍珠質(zhì)層在形貌上差異較大［13，21］。表明同一種晶型的碳酸鈣晶體在貝殼中可構(gòu)成不同的微觀形貌。推測GRSP 對碳酸鈣晶體的形貌及晶型的影響，與其在肌棱柱層中特別是與文石型晶體在肌棱柱層的形成有關(guān)。此外，重組GRSP 對方解石型晶體的結(jié)晶速度具有抑制作用，但對文石型晶體的結(jié)晶速度有輕微促進(jìn)作用（見圖11）。貝殼基質(zhì)蛋白在調(diào)控貝殼形成過程中，通常會通過與碳酸鈣晶體的不同晶面結(jié)合抑制碳酸鈣晶體結(jié)晶［45］，誘導(dǎo)碳酸鈣晶體在不同晶面形成不同的結(jié)晶速度，最終形成不同形貌和晶型的碳酸鈣晶體，從而組裝成生物礦化組織的微觀結(jié)構(gòu)［46］。推測GRSP 也是通過類似作用對碳酸鈣晶體的形貌和晶型產(chǎn)生影響，但重組GRSP 對文石型晶體的促進(jìn)作用仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過密碼子優(yōu)化結(jié)合原核重組表達(dá)技術(shù)，成功獲得重組厚殼貽貝GRSP 蛋白。通過對該蛋白的序列分析和功能研究發(fā)現(xiàn)，作為一種貝殼基質(zhì)蛋白，厚殼貽貝GRSP 可影響碳酸鈣晶體的形貌和晶型，對碳酸鈣晶體的結(jié)晶具有抑制作用，并具有與碳酸鈣晶體結(jié)合的能力。該蛋白可能在厚殼貽貝貝殼的肌棱柱層形成過程中發(fā)揮重要功能，為探究貽貝貝殼的生物礦化機(jī)制以及基于GRSP 的后續(xù)研究奠定一定基礎(chǔ)。

感謝浙江大學(xué)電鏡中心宋丹丹老師在掃描電鏡觀察中的幫助。