陳宏英
(河北省灤平縣衛(wèi)生健康局,河北 灤平 068252)
微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大類,由于多數(shù)微生物的個體較小,肉眼無法觀察,對其計數(shù)一般比較困難。在目前的微生物實驗教學(xué)中,對微生物計數(shù)的方法主要有三大類:總細胞計數(shù)法、活細胞計數(shù)法和微生物生長量測定法。并不是每一種方法都是通用的,不同的微生物種類需要不同的計數(shù)方法,目前多用以下8種方法進行計數(shù):
血細胞計數(shù)板是一塊特制的載玻片,其上劃有計數(shù)室,通過對計數(shù)室中的微生物數(shù)量的讀取,計算原溶液中的微生物數(shù)量。此方法由于計數(shù)板較厚,且計數(shù)室的高度是0.1~,不能采用油鏡進行觀察,故只能對體積較大的真核微生物進行測定,如酵母菌、霉菌抱子等,只能測得所有細胞的總數(shù),不能區(qū)別死細胞和活細胞,尤其是對運動能力強的活細胞難以計數(shù)。目前已經(jīng)提出一些方法,如結(jié)合特定的美藍染色技術(shù),區(qū)別酵母菌死活細胞;將運動的細胞加人甲醛溶液中,破壞其運動以便計數(shù)等。
細菌計數(shù)板是在血細胞計數(shù)板的基礎(chǔ)上改進而來,主要是降低計數(shù)板的厚度,同時將計數(shù)室的高度從0.1~降低到0.02~,以用油鏡對較小的原核微生物進行計數(shù)。
利用計數(shù)板對高濃度的菌液測定比較準確,但當(dāng)樣品中細菌的數(shù)量很低時,如湖水、海水或飲用水等,用膜過濾計數(shù)法更精確些,可以將一定體積樣品溶液加結(jié)晶紫染色,再用0.22卜m的聚偏二氟乙烯膜負壓過濾,再用無菌水沖洗至無色后,將過濾的膜進行抽干,將膜放到載玻片上,滴加甘油,蓋上蓋玻片,即可在顯微鏡下計數(shù)。一般隨機抽取20個視野進行計數(shù),最后算平均數(shù),計算整個濾膜上的菌的數(shù)量,得到原菌液中的微生物數(shù)量。此測定方法一般只能用于樣品中細菌數(shù)量很低的情況,多數(shù)時候細菌個體由于粘附成團而影響結(jié)果。所以,過濾前的細胞分散處理很重要,例如將細菌懸液經(jīng)過酸堿或超聲波處理,將聚團的細胞打散,可以增加此方法的準確性。
平板菌落計數(shù)法只能用于測定活細胞的數(shù)量,但是操作過程相對計數(shù)板而言復(fù)雜一些,而且測得的細菌數(shù)量往往小于實際值。主要原因是在計算細菌濃度時,往往每個菌落并不一定是由一個單細胞生長繁殖而來,有可能是2個或多個,致使結(jié)果比實際菌液樣品中的細菌數(shù)量低,這也就是為什么現(xiàn)在都用菌落形成單位數(shù)(c何mL)來取代過去的絕對細菌數(shù)量。為了使菌落數(shù)更接近實際菌液中細菌的數(shù)量值,目前多數(shù)辦法是:盡量擴大稀釋倍數(shù),涂布平板時少取稀釋菌液,使平板中的菌落數(shù)減少,避免由于菌液中細菌數(shù)過多造成多個細菌形成一個菌落。例如,將系列梯度稀釋至10一8或更低(稀釋倍數(shù)取決于原菌液)。
微生物細胞在一定濃度范圍內(nèi),與濁度成正比,即與光密度成正比,菌越多,光密度越大。故可通過分光光度計測定吸光值,通常測定600nm下的吸光值OD石(X),通過與標準曲線對比,求出樣品中菌液濃度,計算出細胞的數(shù)量。實驗測定時容易出現(xiàn)誤差,必須控制菌濃度在與光密度成正比的線性范圍內(nèi),否則不準確。
對于霉菌的計數(shù)一般比較困難,由于霉菌生長快、菌絲疊加導(dǎo)致無法準確計數(shù)。國標霉菌計數(shù)法的原理是:將待測菌液進行10倍梯度系列稀釋,利用高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO)與待測菌液混勻后倒平板,25℃一28(土1)℃下培養(yǎng)3d后開始計數(shù),選擇菌落數(shù)在10一150之間的平板進行計數(shù),取同稀釋度的兩個平板的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù),即為每g(或mL)檢樣中所含霉菌數(shù)。
蛋白質(zhì)是微生物細胞的主要成分,含量較穩(wěn)定,可以通過測定樣品中含量穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的量計算細菌的數(shù)量,將細胞洗滌收集,用凱氏定氮法測全氮,蛋白質(zhì)含氮量為16%,細菌中蛋白質(zhì)含量因種類的不同而有差別,平均值為65%,根據(jù)每一種微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總含量可以計算出待測樣品中細胞的總質(zhì)量,最后根據(jù)單個細胞的質(zhì)量計算出樣品的細胞數(shù)量??偤颗c蛋白質(zhì)之間的關(guān)系為:蛋白質(zhì)總量=含氮量/16%,那么,微生物細胞總質(zhì)量二蛋白質(zhì)總量/65%,微生物細胞總數(shù)=細胞總質(zhì)量/單個細胞質(zhì)量。每一種微生物細胞的蛋白質(zhì)含量不同,且不同時期的細胞蛋白質(zhì)含量、單個細胞的質(zhì)量都有差別,所以用此方法測定的結(jié)果誤差較大,只能作為參考。
相比凱氏定氮計數(shù)法較大誤差,DNA含量測定法相對較準確。每個微生物細胞的DNA含量非常恒定,平均為8.4xl0-5,將一定體積的細菌懸液離心,從細菌細胞中提取DNA,得其重量,則可計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數(shù)。
本文對常用的8種微生物數(shù)量測定方法進行總結(jié)與比較,血細胞計數(shù)板和細菌計數(shù)板常用于測定單細胞或胞子,相對比較準確;膜過濾用于測定細胞濃度很低的樣品,平板菌落計數(shù)對多數(shù)微生物的測定都適用,但是相對其他計數(shù)法要復(fù)雜;比濁法相對準確,但需要做標準曲線;對于絲狀微生物的數(shù)量測定,國際上有明確的標準;而凱氏定氮法和DNA含量測定法都是通過對微生物細胞內(nèi)含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)進行定量測定,再算出細胞的數(shù)量,操作相對復(fù)雜。