關(guān)于當(dāng)前微生物檢驗(yàn)技術(shù)的分析

陳宏英

（河北省灤平縣衛(wèi)生健康局，河北 灤平 068252）

微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大類，由于多數(shù)微生物的個(gè)體較小，肉眼無法觀察，對(duì)其計(jì)數(shù)一般比較困難。在目前的微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，對(duì)微生物計(jì)數(shù)的方法主要有三大類:總細(xì)胞計(jì)數(shù)法、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法和微生物生長(zhǎng)量測(cè)定法。并不是每一種方法都是通用的，不同的微生物種類需要不同的計(jì)數(shù)方法，目前多用以下8種方法進(jìn)行計(jì)數(shù):

一、總細(xì)胞計(jì)數(shù)法

（一）血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上劃有計(jì)數(shù)室，通過對(duì)計(jì)數(shù)室中的微生物數(shù)量的讀取，計(jì)算原溶液中的微生物數(shù)量。此方法由于計(jì)數(shù)板較厚，且計(jì)數(shù)室的高度是0.1～，不能采用油鏡進(jìn)行觀察，故只能對(duì)體積較大的真核微生物進(jìn)行測(cè)定，如酵母菌、霉菌抱子等，只能測(cè)得所有細(xì)胞的總數(shù)，不能區(qū)別死細(xì)胞和活細(xì)胞，尤其是對(duì)運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的活細(xì)胞難以計(jì)數(shù)。目前已經(jīng)提出一些方法，如結(jié)合特定的美藍(lán)染色技術(shù)，區(qū)別酵母菌死活細(xì)胞;將運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞加人甲醛溶液中，破壞其運(yùn)動(dòng)以便計(jì)數(shù)等。

（二）細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

細(xì)菌計(jì)數(shù)板是在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來，主要是降低計(jì)數(shù)板的厚度，同時(shí)將計(jì)數(shù)室的高度從0.1～降低到0.02～，以用油鏡對(duì)較小的原核微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（三）膜過濾計(jì)數(shù)法

利用計(jì)數(shù)板對(duì)高濃度的菌液測(cè)定比較準(zhǔn)確，但當(dāng)樣品中細(xì)菌的數(shù)量很低時(shí)，如湖水、海水或飲用水等，用膜過濾計(jì)數(shù)法更精確些，可以將一定體積樣品溶液加結(jié)晶紫染色，再用0.22卜m的聚偏二氟乙烯膜負(fù)壓過濾，再用無菌水沖洗至無色后，將過濾的膜進(jìn)行抽干，將膜放到載玻片上，滴加甘油，蓋上蓋玻片，即可在顯微鏡下計(jì)數(shù)。一般隨機(jī)抽取20個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后算平均數(shù)，計(jì)算整個(gè)濾膜上的菌的數(shù)量，得到原菌液中的微生物數(shù)量。此測(cè)定方法一般只能用于樣品中細(xì)菌數(shù)量很低的情況，多數(shù)時(shí)候細(xì)菌個(gè)體由于粘附成團(tuán)而影響結(jié)果。所以，過濾前的細(xì)胞分散處理很重要，例如將細(xì)菌懸液經(jīng)過酸堿或超聲波處理，將聚團(tuán)的細(xì)胞打散，可以增加此方法的準(zhǔn)確性。

二、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法

（一）平板菌落計(jì)數(shù)法

平板菌落計(jì)數(shù)法只能用于測(cè)定活細(xì)胞的數(shù)量，但是操作過程相對(duì)計(jì)數(shù)板而言復(fù)雜一些，而且測(cè)得的細(xì)菌數(shù)量往往小于實(shí)際值。主要原因是在計(jì)算細(xì)菌濃度時(shí)，往往每個(gè)菌落并不一定是由一個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而來，有可能是2個(gè)或多個(gè)，致使結(jié)果比實(shí)際菌液樣品中的細(xì)菌數(shù)量低，這也就是為什么現(xiàn)在都用菌落形成單位數(shù)(c何mL)來取代過去的絕對(duì)細(xì)菌數(shù)量。為了使菌落數(shù)更接近實(shí)際菌液中細(xì)菌的數(shù)量值，目前多數(shù)辦法是:盡量擴(kuò)大稀釋倍數(shù)，涂布平板時(shí)少取稀釋菌液，使平板中的菌落數(shù)減少，避免由于菌液中細(xì)菌數(shù)過多造成多個(gè)細(xì)菌形成一個(gè)菌落。例如，將系列梯度稀釋至10一8或更低(稀釋倍數(shù)取決于原菌液)。

（二）比濁法

微生物細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)，與濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。故可通過分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，通常測(cè)定600nm下的吸光值OD石(X)，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，求出樣品中菌液濃度，計(jì)算出細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)容易出現(xiàn)誤差，必須控制菌濃度在與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。

（三）霉菌計(jì)數(shù)法

對(duì)于霉菌的計(jì)數(shù)一般比較困難，由于霉菌生長(zhǎng)快、菌絲疊加導(dǎo)致無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。國(guó)標(biāo)霉菌計(jì)數(shù)法的原理是:將待測(cè)菌液進(jìn)行10倍梯度系列稀釋，利用高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO)與待測(cè)菌液混勻后倒平板，25℃一28(土1)℃下培養(yǎng)3d后開始計(jì)數(shù)，選擇菌落數(shù)在10一150之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取同稀釋度的兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(或mL)檢樣中所含霉菌數(shù)。

三、微生物生長(zhǎng)量測(cè)定法

（一）凱氏定氮計(jì)數(shù)法

蛋白質(zhì)是微生物細(xì)胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，可以通過測(cè)定樣品中含量穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的量計(jì)算細(xì)菌的數(shù)量，將細(xì)胞洗滌收集，用凱氏定氮法測(cè)全氮，蛋白質(zhì)含氮量為16%，細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量因種類的不同而有差別，平均值為65%，根據(jù)每一種微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總含量可以計(jì)算出待測(cè)樣品中細(xì)胞的總質(zhì)量，最后根據(jù)單個(gè)細(xì)胞的質(zhì)量計(jì)算出樣品的細(xì)胞數(shù)量?？偤颗c蛋白質(zhì)之間的關(guān)系為:蛋白質(zhì)總量=含氮量/16%，那么，微生物細(xì)胞總質(zhì)量二蛋白質(zhì)總量/65%，微生物細(xì)胞總數(shù)=細(xì)胞總質(zhì)量/單個(gè)細(xì)胞質(zhì)量。每一種微生物細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量不同，且不同時(shí)期的細(xì)胞蛋白質(zhì)含量、單個(gè)細(xì)胞的質(zhì)量都有差別，所以用此方法測(cè)定的結(jié)果誤差較大，只能作為參考。

（二）DNA含量測(cè)定法

相比凱氏定氮計(jì)數(shù)法較大誤差，DNA含量測(cè)定法相對(duì)較準(zhǔn)確。每個(gè)微生物細(xì)胞的DNA含量非常恒定，平均為8.4xl0-5，將一定體積的細(xì)菌懸液離心，從細(xì)菌細(xì)胞中提取DNA，得其重量，則可計(jì)算出這一定體積的細(xì)菌懸液所含的細(xì)菌總數(shù)。

本文對(duì)常用的8種微生物數(shù)量測(cè)定方法進(jìn)行總結(jié)與比較，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和細(xì)菌計(jì)數(shù)板常用于測(cè)定單細(xì)胞或胞子，相對(duì)比較準(zhǔn)確;膜過濾用于測(cè)定細(xì)胞濃度很低的樣品，平板菌落計(jì)數(shù)對(duì)多數(shù)微生物的測(cè)定都適用，但是相對(duì)其他計(jì)數(shù)法要復(fù)雜;比濁法相對(duì)準(zhǔn)確，但需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線;對(duì)于絲狀微生物的數(shù)量測(cè)定，國(guó)際上有明確的標(biāo)準(zhǔn);而凱氏定氮法和DNA含量測(cè)定法都是通過對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)含量相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定，再算出細(xì)胞的數(shù)量，操作相對(duì)復(fù)雜。