轉(zhuǎn)基因大麥B-hordein基因熒光定量PCR方法的建立

李靜雯 張正英 王立光 陳軍 朱天地

摘要：為快速定量大麥貯藏蛋白基因B-hordein差異表達，利用SYBR Green I 染料法測定轉(zhuǎn)基因大麥和對照花后10 d籽粒B-hordein表達量，通過RT-PCR擴增B-hordein和內(nèi)參基因actin片段，對PCR退火溫度、引物濃度等進行優(yōu)化，結(jié)合擴增曲線和熔解曲線分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大麥B-hordein基因表達量較對照品種Golden Promise顯著降低（P < 0.05），B-hordein和actin擴增片段分別在（84.51±0.01） ℃和（80±0.01） ℃處顯示特異性單峰，可成功建立轉(zhuǎn)基因大麥B-hordein SYBR Green I實時定量PCR法。

關(guān)鍵詞：SYBR GreenⅠ;熒光定量PCR;轉(zhuǎn)基因大麥;B-hordein

中圖分類號：S512.3? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A? ? ? ?文章編號：1001-1463（2020）11-0011-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.11.003

Abstract：In this study， a qRT-PCR system with SYBR Green I was established to characterise the variation in the expression of B-hordein gene in barley. The target gene B-hordein and the reference gene actin were amplified with RT-PCR in the grain of 10 DAP （day after pollination） of transgenic barley and control. PCR annealing temperature，primers concentration and other reaction factors was optimized， and also the amplification curve and melt curve was analyzed. The results showed that the expression level of B-hordein of transgenic barley was significantly lower than that of control（P < 0.05）. Peak of B-hordein and actin were （84.51±0.01） ℃ and（80±0.01） ℃， respectively， and the real-time quantitative PCR method of B-hordein SYBR Green I in transgenic barley could be successfully established.

Key words：SYBR GreenⅠ;Fluorescent quantitative PCR;Transgenic barley;B-hordein

醇溶蛋白為大麥胚乳中主要的貯藏蛋白，兼具經(jīng)濟和健康價值。人類直接使用大麥時或?qū)⑵渥鳛槭称吩?，或用于啤酒釀造[1 ]。大麥醇溶蛋白分為四類，即由hor-2 編碼的B醇溶蛋白。hor-1編碼的C醇溶蛋白、hor-3編碼的D醇溶蛋白、hor-5 編碼的γ醇溶蛋白[2 ]。B醇溶蛋白在大麥醇溶蛋白中含量最高，為70%～80%;其次是C醇溶蛋白，其含量為總蛋白的10%～20%[2 - 3 ]。研究認(rèn)為，醇溶蛋白對啤酒釀造加工具有負面影響[4 ]，采用基因工程育種技術(shù)可創(chuàng)制醇溶蛋白相關(guān)亞基缺失的專用大麥品種[1 ]。近年應(yīng)用RNAi抑制大麥C-hordein或小麥ω-gliadin成功改變禾谷類作物貯藏蛋白組 成[5 - 6 ]。我們的前期研究以大麥模式品種Golden Promise幼胚為受體材料，利用RNAi抑制大麥B-hordein合成，獲得的轉(zhuǎn)基因大麥醇溶蛋白含量降低，總蛋白含量降低1%～2%[7 ]，現(xiàn)已獲得純系材料，但轉(zhuǎn)基因大麥B-hordein表達量相對于對照如何變化，其在轉(zhuǎn)錄水平的表達是否有遺傳穩(wěn)定性尚不明確。Kaczmarczyk等[3 ]建立實時熒光定量PCR平臺來定量大麥發(fā)育進程中高度同源的醇溶蛋白多基因家族，但國內(nèi)尚未見大麥貯藏蛋白功能標(biāo)記研究相關(guān)報道。

實時熒光定量PCR技術(shù)因其特異性、穩(wěn)定性、自動化程度高等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測、作物育種、醫(yī)療等領(lǐng)域[8 - 10 ]。為研究轉(zhuǎn)基因大麥醇溶蛋白基因的表達模式，我們建立了大麥發(fā)育階段籽粒主要貯藏蛋白B-hordein表達的定量方法，以期為明確大麥貯藏蛋白基因?qū)τ诓煌h(huán)境的響應(yīng)變化和該基因功能標(biāo)記開發(fā)提供方法參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

1.1.1? ? 供試材料? ? 供試材料為甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所創(chuàng)制的RNAi B-hordein 的轉(zhuǎn)基因大麥及對照Golden Promise。

1.1.2? ? 主要試劑和儀器? ? SYBR Premix x TaqTM II購自寶生物工程（大連）有限公司，植物總RNA提取試劑盒（DP441）購自北京天根生化有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（c81401190）購自上海英駿生物技術(shù)有限公司。主要儀器設(shè)備為ABI QuantStudio5 Q5熒光定量PCR儀，NanoDrop one。

1.1.3? ? 引物設(shè)計與合成? ? 用于熒光定量PCR的大麥內(nèi)參基因actin（AY145451）引物用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計（表1），目的基因B-hordein引物同Kaczmarczyk等[3 ]。

1.2? ?試驗方法

試驗于2016年3 — 7月種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ脺厥?，人工條播，行長1 m，行距為20 cm，小區(qū)面積為4 m2，3次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。

1.2.1? ? 籽粒胚乳總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄? ? ? 花后對RNAi株系掛牌標(biāo)記。轉(zhuǎn)基因株系和對照均選取3個生物學(xué)樣本。花后10 d? ? ?9：00～10：00時從每個單株穗中部選取發(fā)育籽粒2粒，迅速置于液氮中冷凍保存，之后于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

采用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚總RNA提取試劑盒提取大麥籽粒RNA。每樣本取2 μL RNA用NanoDrop one測定260、280 nm處的吸光值（以無 RNase 水為空白液調(diào)零）。計算A260/280的值，估算總RNA的純度，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

取各樣本RNA 0.02 μg，按照Invitrogen GoldScript cDNA合成試劑盒進行操作，合成cDNA第1鏈。以cDNA及RNA為模板，進行內(nèi)參基因actin PCR擴增。用于PCR的actin引物序列與反應(yīng)程序同李靜雯等[7 ]。

1.2.2? ? B-hordein的普通PCR? ? 以反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，Common BF/BR擴增目的基因B-hordein，在其他條件不變的情況下，分別對引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化，引物濃度為0.1～0.5 μmol/L，退火溫度為56～62 ℃內(nèi)進行優(yōu)化。

1.2.3? ? SYBR GreenⅠqRT-PCR反應(yīng)程序? ? 采用SYBR GreenⅠ染料法，在Q5定量PCR儀上進行目的基因B-hordein和內(nèi)參基因actin檢測。按照TB GreenTM Ex TaqTM II 說明建立反應(yīng)體系，1 μL 100 ng/μL cDNA，每個模板3個重復(fù)。反應(yīng)程序為：95 ℃變性3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，進行35個循環(huán)。在72 ℃延伸階段進行末點熒光檢測，每上升0.5 ℃收集1次熒光基因表達相對量，采用2-ΔCt方法計算[9 ]。

1.3? ?數(shù)據(jù)處理

分別用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理和方差分析 。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?RNA的純度和完整性

采用TIANGEN RNAprep Pure 多糖多酚總RNA提取試劑盒（DP441）提取轉(zhuǎn)基因大麥和對照花后10 d的籽粒RNA。所提總RNA中28S rRNA和18S rRNA條帶清晰可見清晰，二者比例接近2∶1，電泳條帶無拖尾，表明RNA無降解，蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)去除較干凈，且加樣孔內(nèi)無任何基因組DNA 殘留，質(zhì)量相對較好（圖1）。RNA樣品的A260/A280值為1.88～2.11，說明樣品具有較高的純度，可滿足下一步反轉(zhuǎn)錄實驗要求。

2.2? ?cDNA的合成及檢測

采用內(nèi)參引物同時擴增所提取RNA及反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。結(jié)果表明（圖2），所提取RNA樣本未擴增出內(nèi)參基因目的條帶，相應(yīng)的cDNA均擴增出540 bp大小的目的條帶，表明所提取的RNA無基因組DNA污染，并且cDNA反轉(zhuǎn)錄成功，可用于熒光定量PCR實驗。

2.3? ?B-hordein的普通PCR

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別在引物濃度為0.1～0.5 μmol/L、退火溫度在56～62 ℃條件下進行優(yōu)化。最終引物濃度為0.3 μmol/L，退火溫度為57 ℃。得到約119 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。

2.4? ?實時熒光定量PCR的優(yōu)化條件

在普通PCR的基礎(chǔ)上，獲得了B-hordein基因?qū)崟r熒光定量PCR的最佳反應(yīng)體系和條件。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為10 uL：SYBR Premix ex Taq 5 uL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 uL，100 ng/μL cDNA 1 uL;去離子水3.2 uL;反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，進行35 個循環(huán)。最佳退火溫度為57 ℃，最佳引物終濃度為0.4 μmol/L。

2.5? ?擴增曲線和溶解曲線分析

以優(yōu)化好的條件進行熒光定量qRT-PCR 擴增，擴增樣品同一引物的擴增曲線平滑，且相同樣品的3次擴增曲線位置相近（圖4），表明不同樣品中相同引物的擴增效率一致，重復(fù)性好。B-hordein和actin擴增片段分別在熔解溫度（84.51±0.01） ℃和（80±0.01） ℃處顯示特異性單峰（圖5），說明實時熒光定量PCR引物特異性較好，實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

2.6? ?轉(zhuǎn)基因大麥花后10 d的籽粒B-hordein基因表達分析

采用已建立的SYBR GreenⅠqRT-PCR方法，對轉(zhuǎn)基因大麥及對照花后10 d B-hordein 基因表達進行定量分析。結(jié)果（圖6）表明，相對于對照，RNAi轉(zhuǎn)基因大麥B-hordein表達量顯著降低（P < 0.05）。

3? ?小結(jié)與討論

本研究采用SYBR GreenⅠ雙鏈嵌合染料法檢測B-hordein表達，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因大麥B-hordein基因表達量較對照顯著降低0.9倍，這與我們前期采用半定量RT-PCR定性分析的結(jié)果一致[7 ]，驗證了本實驗所建立的qRT-PCR方法能夠有效區(qū)分不同大麥材料發(fā)育階段籽粒B-hordein表達量，而且用時短、通量高、擴增效率高、重復(fù)性強。

熒光定量PCR能夠快速和準(zhǔn)確地分析出植物在不同處理條件下基因表達量差異，已在大豆、玉米、油菜、水稻等多種農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因檢測和育種研究得以應(yīng)用[8 ]。SYBR GreenⅠ作為一種常用的核酸染料可用于PCR產(chǎn)物的檢測，主要是因為其選擇性的結(jié)合于雙鏈DNA的小溝，使得熒光強度顯著增強。本研究基于大麥cDNA進行B-hordein 基因?qū)崟r定量PCR分析，對體系中引物濃度、退火溫度進行優(yōu)化，建立了檢測轉(zhuǎn)基因大麥發(fā)育籽粒B-hordein mRNA表達量的方法。

前人研究表明，不同醇溶蛋白組分含量在籽粒發(fā)育階段略有變化，總的醇溶蛋白轉(zhuǎn)錄從花后10 d持續(xù)升高，其中B-醇溶蛋白基因比例高于其他醇溶蛋白基因比例（高達80%）[3 ]。B-hordein 是一個有近34個成員的多基因家族[11 ]，研究者針對該基因已知序列設(shè)計PCR引物，鑒定了大量的B-hordein序列[3，12 - 13 ]。醇溶蛋白在發(fā)育早期的瞬時表達是由于每一個基因家族受到不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Hansen等[14 ]通過基因芯片數(shù)據(jù)可區(qū)分大麥品種Barke貯藏蛋白家族成員的瞬時表達變異。我們主要針對B-hordein基因總體表達趨勢進行了定量分析，明確RNAi轉(zhuǎn)基因大麥純合株系中該基因表達量顯著降低，B-hordein和actin擴增片段分別在（84.51±0.01） ℃和（80±0.01） ℃處顯示特異性單峰，可成功建立轉(zhuǎn)基因大麥B-hordein SYBR Green I實時定量PCR法，為創(chuàng)制對氮素不敏感的低醇溶蛋白大麥新種質(zhì)及定量醇溶蛋白各亞基基因表達提供支持。

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（本文責(zé)編：陳? ? 偉）