多抗轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得及農(nóng)桿菌介導(dǎo)試管薯遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

齊恩芳 賈小霞 劉石 陳曉艷 黃偉 劉世海

摘要：以馬鈴薯品種隴薯11號(hào)試管薯為受體材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒CP融合基因?qū)腭R鈴薯，并對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，薯片分化和生根階段的選擇壓分別為Kan 50、75 mg/L，薯片分化和生根階段有效抑菌濃度分別為Cb 500、200 mg/L，農(nóng)桿菌活化時(shí)間為4.5 h、侵染時(shí)間為7 min、共培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)利于遺傳轉(zhuǎn)化。通過該體系將4種病毒CP融合基因?qū)腭R鈴薯，獲得了具卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)PCR檢測(cè)，外源基因已導(dǎo)入馬鈴薯基因組中。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯;試管薯;農(nóng)桿菌介導(dǎo);遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S532? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2020）11-0001-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.11.001

Abstract：The CP fusion genes of PVX， PVS， PVY and PLRV were transferred into Longshu 11 test tube potato through the agrobacterium-mediated method， and condtions of which was also optimized. The results showed the optimal Kan selective concentration is 50 mg/L and 75 mg/L for potato chip differentiation and root germination respectively， and Cb is 500 mg/L and 200 mg/L. The optimal transformation conditions： agrobacterium should be actived for 4.5 hours， transfection for 7 minutes， and co-cultivation time for 2 days， it was beneficial to genetic transformation. Via this system， four viral CP fusion gene were introduced into potatoes， and later transformed plants with kanamycin resistance were obtained. PCR detection confirmed the fusion gene had been successfully introduced into those potato genome.

Key words：Potato;Tube potato;Agrobacterium mediated;Genetic transformation

馬鈴薯是一種產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的宜糧、宜菜、宜飼、宜作工業(yè)原料的經(jīng)濟(jì)作物[1 - 2 ]。馬鈴薯在生長(zhǎng)期間易受多種病毒的危害，病毒侵染造成馬鈴薯種質(zhì)退化，產(chǎn)量嚴(yán)重降低。迄今為止，幾乎沒有有效的化學(xué)藥劑來防治病毒病，目前解決馬鈴薯退化的有效途徑是組培脫毒，但該法成本高且工作量大，不能解決病毒的再侵染問題，能維護(hù)無毒或低毒的有效期不長(zhǎng)，2～3 a后產(chǎn)量又會(huì)嚴(yán)重下降。馬鈴薯是同源四倍體作物，若采用常規(guī)方法選育抗病毒品種，則存在天然抗性基因資源缺乏，且育種周期長(zhǎng)、抗性基因的遺傳不穩(wěn)定以及遠(yuǎn)緣雜交種間障礙等問題。馬鈴薯抗病毒基因工程的發(fā)展解決了這一難題，通過基因工程改良馬鈴薯品種具有基因明確、產(chǎn)物已知、目標(biāo)具體、準(zhǔn)確快速、可預(yù)見性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，且馬鈴薯是無性繁殖植物，轉(zhuǎn)基因植株無性后代不發(fā)生分離，給轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)、鑒定帶來諸多方便。

建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)于獲得轉(zhuǎn)基因植株至關(guān)重要。在馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化中以葉片、莖段、薯片作為受體已廣泛應(yīng)用，其中試管薯片作為受體材料傷口面積大，且薯塊本身含有較高含量的酚類物質(zhì)，有助于農(nóng)桿菌的侵染和轉(zhuǎn)化[3 - 5 ]，不經(jīng)愈傷化可直接誘導(dǎo)芽再生。薯片轉(zhuǎn)化過程中不需要預(yù)培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單方便，周期短，但針對(duì)不同基因型轉(zhuǎn)化的適宜條件有一定差異。我們以馬鈴薯品種隴薯11號(hào)脫毒試管苗為材料，采用農(nóng)桿菌菌株LBA4404為介導(dǎo)，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒外殼蛋白融合基因?qū)腭R鈴薯，并通過對(duì)選擇壓、抗菌素濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行選擇，建立了一套優(yōu)化的高效轉(zhuǎn)化體系。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

供試材料為馬鈴薯品種隴薯11號(hào)脫毒苗，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室提供。供試菌株LBA4404含有質(zhì)粒pART27-XSYV-rh（甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）[6 ]，pART27- XSYV-rh含4 種病毒（PVX、PVS、PVY 和 PLRV）CP基因片段，抗性標(biāo)記為卡拉霉素（Kan）。DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分、植物激素、抗生素、添加劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2? ?培養(yǎng)基

YEP液體培養(yǎng)基為10 g/L酵母提取物+ 10 g/L蛋白胨+5 g/L牛肉膏。試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+6-芐氨基嘌呤（6-BA）5 mg/L。試管薯片分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+吲哚乙酸（IAA）1.0 mg/L+赤霉素（GA3）0.2 mg/L+6-芐氨基嘌呤（6-BA）0.5 mg/L+玉米素核苷（ZT）2.0 mg/L。生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基。

1.3? ?轉(zhuǎn)化外植體的獲得

將隴薯11號(hào)試管苗在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d，長(zhǎng)成壯苗后用于誘導(dǎo)試管薯。參照“固體+液體”的方法誘導(dǎo)試管苗結(jié)薯[7 ]。

1.4? ?遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

1.4.1? ? 誘導(dǎo)芽與生根選擇壓確定? ? 無菌條件下取直徑約為0.5 cm的隴薯11號(hào)試管薯，切成厚度為2 mm左右的薄片，分別接種于附加0、25、50、75、100 mg/L 卡拉霉素（Kanamycin，Kan）的試管薯片分化培養(yǎng)基中，每處理接種20塊，3次重復(fù)，間隔14 d繼代1次，接種28 d后觀察薯片生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)出芽率，確定抑制芽分化的最低Kan濃度。將隴薯11號(hào)試管苗剪成帶2個(gè)腋芽的莖段，分別接到含Kan濃度0、25、50、75、100 mg/L的生根培養(yǎng)基中，3個(gè)重復(fù)，21 d后觀察并記錄生根狀況，確定抑制生根最適Kan濃度。

1.4.2? ? 農(nóng)桿菌工程菌生長(zhǎng)曲線? ? 挑取農(nóng)桿菌菌種，接種于含Kan 50 mg/L、鏈霉素（Streptomycin，Str）50 mg/L和利福平（Rifampicin，Rif）20 mg/L的YEP平板上，置28 ℃暗培養(yǎng)，2 d后挑取單菌落放入5 mL含有同樣抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、260 rpm條件下避光振蕩培養(yǎng)約24～36 h。將活化好的菌液按1∶50放大培養(yǎng)（即取1 mL活化好的菌液加入到50 mL含Kan 50 mg/L、Str 50 mg/L、Rif 20 mg/L的YEP液體培養(yǎng)基中，再置于28 ℃恒溫?fù)u床，260 rpm條件下避光振蕩培養(yǎng)），分別設(shè)1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 h共13個(gè)時(shí)間梯度，每個(gè)時(shí)間段各取2 mL菌液，在波長(zhǎng)600 nm下用分光光度計(jì)測(cè)定其紫外吸收值OD600，每處理3次重復(fù)，用未加菌液的YEP液體培養(yǎng)基調(diào)零，計(jì)算3次重復(fù)樣品的OD600平均值，最終確定農(nóng)桿菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所需的搖菌時(shí)間（即OD600=0.5左右的臨界點(diǎn)）。

1.4.3? ? 侵染時(shí)間? ? 用OD600=0.5的農(nóng)桿菌菌液侵染薯片，侵染時(shí)間設(shè)為3、5、7、9、11、13、15 min，接種于試管薯片分化培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿20塊，每處理3次重復(fù)，20 d后統(tǒng)計(jì)薯塊出芽率、污染率及褐化率。

出芽率=（出抗性芽薯塊數(shù)/接種薯塊總數(shù)）×100%

污染率=（污染的薯塊數(shù)/接種薯塊總數(shù)）×100%

褐化率=（褐化的薯塊數(shù)/接種薯塊總數(shù)）×100%

1.4.4? ? 共培養(yǎng)時(shí)間? ? 選擇侵染7 min的處理置于28 ℃、黑暗條件下共培養(yǎng)，共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為1、2、3、4 d，30 d后觀察薯塊生長(zhǎng)狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)出芽率。

1.4.5? ? 抑菌劑濃度? ? 將共培養(yǎng)后的薯塊分別轉(zhuǎn)接到附加羧芐青霉素（Carbenicillin，Cb）100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的試管薯片分化培養(yǎng)基中，光照時(shí)間為14 h/d，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，7 d后觀察農(nóng)桿菌溢出情況。將分化出的芽分別轉(zhuǎn)接到附加Cb 100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的生根培養(yǎng)基中，7 d后觀察農(nóng)桿菌溢出情況。

1.5? ?轉(zhuǎn)基因植株鑒定

采用CTAB法提取待檢測(cè)植株和對(duì)照植株葉片總DNA，參照賈小霞等[8 ]的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株進(jìn)行PCR鑒定。以非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株為陰性對(duì)照，pART27- XSYV-rh質(zhì)粒為陽性對(duì)照。反應(yīng)程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min。取5 uL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，分離并觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?Kan濃度對(duì)試管薯片芽分化及生根的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，試管薯片在芽分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～21 d后，不加Kan的薯片直接分化長(zhǎng)出綠色健壯小芽。Kan濃度為25 mg/L時(shí)，薯片增厚、變大、顏色鮮綠，分化出芽情況與不加Kan無明顯差異;Kan濃度為50 mg/L時(shí)，薯片稍有膨大，顏色暗綠，不能分化出芽;Kan濃度為75 mg/L時(shí)，部分薯片膨大，顏色發(fā)暗，褐化嚴(yán)重;Kan濃度為100 mg/L時(shí)，薯片全部褐化死亡。因此確定芽誘導(dǎo)時(shí)Kan濃度為50 mg/L。

在抗性芽生根階段仍需要加入Kan，以防止產(chǎn)生大量假陽性植株。接種28 d后，不加Kan的植株生長(zhǎng)旺盛，根系發(fā)達(dá)，而加入Kan的處理雖然也有植株生長(zhǎng)，但是隨著Kan濃度的增加生根受限。Kan濃度為25 mg/L時(shí)，植株生根正常;Kan濃度為50 mg/L時(shí)，能正常生根，但植株生長(zhǎng)緩慢;Kan濃度為75 mg/L時(shí)，部分植株生根，葉片發(fā)黃;Kan濃度為100 mg/L時(shí)，幾乎沒有根系，葉片全部發(fā)黃。因此確定生根時(shí) Kan濃度為75 mg/L。

2.2? ?農(nóng)桿菌工程菌活化時(shí)間確定

農(nóng)桿菌液活化時(shí)間對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化的效果至關(guān)重要，活化時(shí)間短，菌液濃度過低，不利于侵染，轉(zhuǎn)化率較低，菌液濃度過高，容易使薯片傷口褐化死亡。從含有質(zhì)粒pART27-XSYV-rh的農(nóng)桿菌LBA4404- pART27- XSYV- rh的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果（表1）?？梢钥闯?，活化培養(yǎng)時(shí)間為4.5 h左右時(shí)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)最快。

2.3? ?侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

侵染時(shí)間影響轉(zhuǎn)化效率，時(shí)間太短不利于農(nóng)桿菌的附著，時(shí)間過長(zhǎng)，容易導(dǎo)致菌的滋生，溢出的菌液會(huì)過多而無法控制，下一步除菌時(shí)不容易清除干凈，易導(dǎo)致薯片褐化死亡。通過表2可以看出，侵染時(shí)間為7 min時(shí)出芽率達(dá)到50.0%，褐化率、污染率相對(duì)較低，因此選擇侵染7 min為轉(zhuǎn)化條件。

2.4? ?共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)薯塊誘導(dǎo)出芽有很大影響，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，污染加重，出芽率下降。可能是因?yàn)檗r(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)的時(shí)間過長(zhǎng)，農(nóng)桿菌過度繁殖使其生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過外植體細(xì)胞的分裂分化能力，致使外植體發(fā)生重度感染而出現(xiàn)軟腐現(xiàn)象，最終失去再生愈傷能力。通過表3可以看出，試管薯塊最佳共培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)最佳，出芽率達(dá)到75.0%，污染率為10.0%。

2.5? ?Cb對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

抗性愈傷篩選過程中需要及時(shí)去除農(nóng)桿菌，否則整個(gè)外植體將會(huì)腐爛致死，無法再生，嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化。為了抑制和殺死農(nóng)桿菌菌株，需要在抗性愈傷篩選過程中加入一定濃度的抗生素。不同抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果不同，同種抗生素不同濃度對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果也不同。在芽分化和生根階段加入不同濃度Cb的結(jié)果（表4）表明，當(dāng)Cb濃度為500 mg/L時(shí)，才能有效抑制薯塊芽分化階段的農(nóng)桿菌溢出，植株生長(zhǎng)表面無不良反應(yīng)，生長(zhǎng)變慢，但基本上不影響出芽;而在生根階段，Cb濃度為200 mg/L時(shí)就能很好地抑制農(nóng)桿菌的溢出，不影響植株生長(zhǎng)。

2.6? ?轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

試管薯薄片分化出芽后（圖1A），待抗性芽長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)剪下接入附加有Kan 75 mg/L 和Cb 200 mg/L 的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，14 d后生根生長(zhǎng)則繼續(xù)轉(zhuǎn)接，經(jīng)3次相同濃度Kan抗性生根篩選后，獲得正常生長(zhǎng)的20株抗性植株（圖1B）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果（圖2）表明，6株抗性苗DNA能擴(kuò)增出分子量約為1 200 bp左右的特異性目的片段，而非轉(zhuǎn)化植株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，初步證明這6株再生植株為轉(zhuǎn)基因植株。

3? ?小結(jié)與討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化方法已廣泛應(yīng)用，但針對(duì)不同的基因型、不同的外植體，轉(zhuǎn)化效果差異仍很大，要根據(jù)具體基因型和外植體進(jìn)行優(yōu)化選擇。作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，必須具備來源充足、再生頻率高、再生穩(wěn)定、遺傳穩(wěn)定性好、培養(yǎng)時(shí)間短和對(duì)標(biāo)記選擇性抗生素敏感等特點(diǎn)[9 ]。在馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，以莖段、葉片、塊莖和試管薯為受體的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化均已獲得成功。李晶等[10 ]對(duì)馬鈴薯再生培養(yǎng)基、基因型、外植體類型進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，將幾丁質(zhì)酶（chi）基因成功導(dǎo)入馬鈴薯東農(nóng)303;邢小萍[11 ]以葉盤、莖段、葉柄為外植體，將抗菌肽基因?qū)腭R鈴薯甘農(nóng)薯 1號(hào)，并對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的主要條件進(jìn)行了篩選;尤佳 等[12 ]用馬鈴薯栽培品種隴薯3號(hào)和甘農(nóng)薯2號(hào)試管薯為外植體，獲得了轉(zhuǎn)基因植株;李珺等[13 ]用蠟質(zhì)馬鈴薯突變植株的莖段作為外植體，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)化率約為34%。本試驗(yàn)以馬鈴薯品種“隴薯11號(hào)”試管薯為外植體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功轉(zhuǎn)化馬鈴薯，并對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化體系中關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化。

在植物轉(zhuǎn)化過程中，既能夠有效地去除農(nóng)桿菌侵染所造成的污染又要不影響植株正常生長(zhǎng)，同時(shí)又能夠有效選擇出轉(zhuǎn)基因陽性植株。此過程涉及抗生素種類和濃度的正確選擇過程，該階段也是轉(zhuǎn)化試驗(yàn)順利進(jìn)行的一個(gè)前提條件。抑菌素種類的選用與農(nóng)桿菌的類型有關(guān)，有研究表明Cb對(duì)多個(gè)農(nóng)桿菌菌株都有較強(qiáng)的抑制作用[13 ]。本試驗(yàn)選用Cb來抑制遺傳轉(zhuǎn)化過程中農(nóng)桿菌的滋生，在芽分化和生根階段分別用Cb 500 mg/L和200 mg/L來抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，與張寧等[4 ]、尤佳等[12 ]的研究結(jié)果一致。因?yàn)楸驹囼?yàn)選用的載體pBI121所含的選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因（npt-Ⅱ），該基因?yàn)镵an抗性基因，其轉(zhuǎn)化的組織或器官能在含有一定濃度的Kan培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，反之未被轉(zhuǎn)化的組織或器官將會(huì)死亡。試驗(yàn)選用Kan 50 mg/L 作為芽分化階段的篩選壓力，選用Kan 75 mg/L作為生根階段篩選壓力。侵染和共培養(yǎng)時(shí)間在遺傳轉(zhuǎn)化中舉足輕重，侵染時(shí)間太短，共培養(yǎng)時(shí)無農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化失敗;侵染時(shí)間太長(zhǎng)，常因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐，確定農(nóng)桿菌活化時(shí)間為4.5 h，薯塊侵染時(shí)間為7 min，有助于減輕后續(xù)培養(yǎng)中細(xì)菌對(duì)植物的毒害作用，提高轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)過程是為了使農(nóng)桿菌能夠很好地在外植體上附著，在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間將質(zhì)粒T-DNA轉(zhuǎn)移到外植體的細(xì)胞中，從而完成轉(zhuǎn)化過程。最佳共培養(yǎng)時(shí)間的確定是為了使農(nóng)桿菌附著外植體表面后有足夠的時(shí)間在創(chuàng)傷部位誘發(fā)腫瘤，因此共培養(yǎng)時(shí)間不能太短;若共培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)由于農(nóng)桿菌的過度生長(zhǎng)而使外植體受到毒害死亡，即便不死亡也會(huì)在后續(xù)培養(yǎng)中難以控制。本試驗(yàn)確定共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，此時(shí)外植體周圍剛出現(xiàn)白色菌落，選擇這個(gè)時(shí)間既能提高轉(zhuǎn)化效率，又易去除農(nóng)桿菌。

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（本文責(zé)編：陳? ? 偉）