云南漢族CRHBP基因多態(tài)性與精神分裂癥及其攻擊行為的相關性分析

陳陽，胡利平，劉林林，張秀峰，計艾岑，李佳玨，聶勝潔

（1.昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.湖南迪安司法鑒定中心，湖南 長沙 410006）

下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸釋放促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotrophin-releasing hormone，CRH）、促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）和糖皮質激素（glucocorticoid，GC），是應激反應的重要基礎。當有害應激持續(xù)發(fā)生時，CRH功能亢進，皮質醇的水平和活性升高，精神分裂癥患者ACTH、CRH水平高于正常對照組[1]，HPA軸急性應激能誘導患者攻擊行為，與基底皮質醇負相關[2]。促腎上腺皮質激素釋放激素結合蛋白（corticotropin-releasing hormone binding protein，CRHBP）通過與CRH結合影響HPA軸功能，與海馬神經元的發(fā)育、細胞凋亡等神經行為相關聯[3]。但目前有關CRHBP基因多態(tài)性與精神疾病及行為的相關性研究尚淺，且主要集中于抑郁癥、自殺行為[4-5]。因此，本研究篩選CRHBP基因的4個標簽單核苷酸多態(tài)性（tag single nucleotide polymorphism，Tag SNP）位點，在云南漢族群體中采用病例對照研究方法對其與精神分裂癥及患者攻擊行為的相關性進行探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究已獲得昆明醫(yī)科大學倫理委員會的批準，所有受試者或監(jiān)護人均知情同意。

收集云南省石林縣、宜良縣無關個體163例為病例組（男性96例，女性67例），其中伴攻擊行為（伴打人、罵人、毀物等攻擊行為）81例，不伴攻擊行為82例。診斷嚴格按照《精神障礙診斷及統(tǒng)計手冊（第4版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，the fourth revised edition，DSM-IV）[6]的標準執(zhí)行，精神行為檢查和評估均由云南省精神病醫(yī)院兩位副主任醫(yī)師及副主任以上職稱的專業(yè)精神科醫(yī)生完成。

納入標準：（1）云南漢族；（2）除煙草和咖啡因外，6個月內未有其他藥物濫用史。排除標準：（1）肝腎代謝功能異常；（2）合并明顯的軀體疾病、神經系統(tǒng)疾病和其他精神障礙；（3）除煙草和咖啡因外，6個月內有其他藥物濫用史；（4）妊娠期或哺乳期婦女。

對照組來自云南省昆明市疾病預防控制中心健康體檢的無關個體345例，無精神病史、酒精依賴史、藥物濫用史且年滿18周歲的健康云南籍漢族個體。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物設計

采用經典酚-氯仿法提取全血基因組DNA。根據HapMap數據庫（http://www.hapmap.org/index.html.ja）上中國漢族人群SNP基因分型數據，按照r≥0.8、最小等位基因頻率（minor allel frequency，MAF）＞0.1的標準[7]，運用Haploview 4.2（美國Broad公司）篩選出CRHBP基因的4個Tag SNP（rs7721799、rs32897、rs7718461和rs10062367），其野生型等位基因依次為G、T、G、G。引物及連接探針用Primer Premier 5.0（加拿大Premier公司）軟件設計（表1）。

表1 4個SNP位點及其引物與探針序列Tab.1 The primers and probe sequences of 4 SNP

1.2.2 復合擴增體系建立

10 μL 擴增體系：5.13 μL 雙蒸水（double distilled H2O，ddH2O）、1 μL 10×緩沖液（日本Takara公司）、0.6 μL Mg2+（25 mmol，德國Qiagen公司）、1.2 μL dNTP（2.5mmol，美國Promega公司）、1μL引物混合物（1.0 μmol，上海天昊生物科技有限公司）、0.07 μL HotStarTaq DNA聚合酶（5 U/μL，德國Qiagen公司）、1 μL DNA模板（1～5 ng/μL）。9700型PCR儀（美國Applied Biosystems公司）程序：94℃ 2min；94℃ 20s，65℃（每個循環(huán)下降0.5℃） 40 s，72℃ 30 s，循環(huán)11次；94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1min，循環(huán)24次。

產物純化：10 μL PCR產物、1 μL蝦堿性磷酸酶（1U/μL，美國NEB公司）、0.05μL核酸外切酶（20U/μL，美國NEB公司），37℃ 1h，75℃ 15min。

1.2.3 改良的多重高溫連接酶反應

改良的多重高溫連接酶反應（improve multiplex ligase detection reaction，iMLDR）即在Taq DNA連接酶的作用下，當SNP位點上下游兩條寡核苷酸探針與目的DNA序列完全互補，且兩條探針之間沒有空隙時發(fā)生連接反應。

10 μL 反應體系：PCR 純化產物 3 μL、ddH2O 5.15 μL、10×連接酶緩沖液［NEB（北京）有限公司］1 μL、高溫連接酶［NEB（北京）有限公司］0.5 μL、通用探針混合液0.25 μL、特異連接探針混合液（1.0 μmol） 0.1 μL。反應程序：94 ℃ 10 min，56 ℃1 min，循環(huán)38次。利用3100基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）分析，0.5μL連接產物與9.5μL含0.5 μL GeneScan-120Liz內標（美國Applied Biosystems公司）的高度去離子甲酰胺（Highly deionizedformamide，HiDi）混合，95 ℃ 5 min，冰浴3 min。通過GeneMapperIDv3.2（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行數據分析和基因分型。

1.3 統(tǒng)計分析

應用Haploview 4.2進行Hardy-Weinberg平衡檢驗、連鎖不平衡分析。連鎖不平衡指的是不同遺傳標記間存在著的非隨機組合。D’是一個和基因頻率無關的連鎖不平衡系數，取值范圍是0（連鎖平衡）到1（完全連鎖不平衡，即兩個位點間沒有發(fā)生重組）[8]。SPSS 19.0（美國IBM公司）對基因型、等位基因頻率及顯隱性遺傳模型進行邏輯回歸分析，顯性模型為野生純合子vs野生突變雜合子+突變純合子，隱性模型為野生純合子+野生突變雜合子vs突變純合子。應用PHASE 2.1（英國曼徹斯特大學開發(fā)）構建單倍型，SPSS 19.0對單倍型頻率進行回歸分析。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 單位點分析

各位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。各位點基因型及等位基因頻率分布及邏輯回歸分析結果顯示，rs7718461位點等位基因頻率在病例組與對照組、病例組伴攻擊行為與病例組不伴攻擊行為的分布差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），基因型頻率在病例組伴攻擊行為和病例組不伴攻擊行為中的分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）；其余3個位點的基因型和等位基因頻率在病例組與對照組、病例組伴攻擊行為與病例組不伴攻擊行為之間分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。顯隱性遺傳模型回歸分析結果顯示，rs7718461的GG或GA基因型攜帶者伴攻擊行為的風險大于AA基因型攜帶者［P=0.003，比值比（odds ratio，OR）為4.903，95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）為 1.740～13.814］。

2.2 多位點分析

連鎖不平衡分析結果（圖1）顯示，在云南漢族個體中，病例組與對照組、病例組伴攻擊行為與病例組不伴攻擊行為各位點之間存在連鎖不平衡現象。

單倍型分析結果顯示，所有單倍型分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 rs7718461位點基因型及等位基因頻率分布Tab.2 Genotype and allele frequency distribution of rs7718461

圖1 各組SNP連鎖圖（D’）Fig.1 Every group’s linkage map（D’）of SNP

3 討論

有研究結果[1，9]表明，HPA軸相關基因多態(tài)性在精神分裂癥患者及其攻擊行為中可能發(fā)揮著重要的作用。CRHBP蛋白與CRH的親和力比CRHR1和CRHR2更高[8]，由于其細胞特異性和表達復雜性，一方面可能通過抑制CRH的活性降低個體精神障礙的風險，另一方面通過增強CRH的下游信號，可能引發(fā)CRH功能亢進導致精神疾病及行為[10]。目前，國內外關于CRHBP基因與精神分裂癥患者除自殺以外的攻擊行為相關性研究較少。本研究結果顯示，在不考慮性別及年齡因素的情況下，CRHBP基因rs7718461位點以外的3個Tag SNP位點與精神分裂癥均無關聯（P＞0.05）。對rs7718461位點的隱性遺傳模型進行邏輯回歸分析結果顯示，純合子AA基因型能顯著減輕患者攻擊行為的風險（P=0.003，OR為4.903，95%CI為1.740～13.814）。根據SHEIKH等[11]研究發(fā)現，學齡前兒童CRHBP基因rs10473984和rs32897 GG攜帶者皮質醇活性顯著高于其他基因型攜帶者。DAVYDOW等[12]研究發(fā)現，CRHBP基因rs10055255位點TT攜帶患者的創(chuàng)傷后應激障礙和抑郁癥狀明顯少于其他兩種基因型攜帶者，ROY等[5]研究發(fā)現，同時攜帶FKBP5基因rs3800373 CC和CRHBP基因rs7728378 CC的童年創(chuàng)傷后個體自殺未遂的案例顯著多于攜帶其他基因型的個體。RIBBE等[13]研究發(fā)現，CRHBP基因rs3811939多態(tài)性顯著影響精神分裂癥患者酒精使用障礙，DE LUCA等[9]研究發(fā)現，CRHBP基因多態(tài)性與精神分裂癥患者自殺行為顯著相關。本研究結果與上述研究結果均提示CRHBP基因多態(tài)性直接或間接地調控基因表達后可能通過CRH與精神分裂癥患者行為有一定關系，但精神分裂癥作為復雜的多基因遺傳疾病，單基因的作用相對較弱，需要進一步分析CRHBP基因和HPA軸上其他相關受體基因的交互作用。另外，急性應激、糖皮質激素、雌激素、促性腺激素釋放激素等均能正向調控CRHBPmRNA的表達[10]，性別、年齡、職業(yè)等人口分層，高血壓和糖尿病等慢性疾病家族病史均可能對分析結果產生影響。因此，進一步擴大樣本、優(yōu)化樣本結構，進行多民族、多基因的研究，有利于深入明確CRHBP基因在精神分裂癥發(fā)病、發(fā)展中的遺傳機制。然而，由于攻擊行為可能沒有精神分裂癥的遺傳機制復雜，而且伴或不伴攻擊行為的個體均是精神分裂癥患者，體現在樣本結構的影響因素分析時可能比精神分裂癥的相關性研究更易實施。