應(yīng)用于文物保護的生物技術(shù)述略

馮正騰

一、前言

文物見證歷史，歷經(jīng)較長時間，在環(huán)境中受到很多因素影響，會產(chǎn)生多種病害，如有機質(zhì)文物（紙張、皮革、布匹等）的霉斑、黏連、前人的不當修復、糟朽、褪色等；石質(zhì)文物的開裂、表面形成黑色的硬殼、風化現(xiàn)象等；竹木漆器類文物飽水、開裂、降解等[1]。

適當?shù)念A防及搶救保護方法可以延長文物的“壽命”。隨著科技發(fā)展，文物保護理念及技術(shù)手段也在不斷積累經(jīng)驗和創(chuàng)新，目前的文物保護手段多以物理和化學方法為主。不恰當?shù)男迯褪侄螘е聡乐氐暮蠊?，猶如摸著石頭過河。微生物在文物上生存會形成有一定穩(wěn)定性的生態(tài)系統(tǒng)，某些微生物對文物的破壞會占主導地位，如果這個生態(tài)系統(tǒng)被破壞，則會形成新的平衡[2]。拉斯科巖洞自1940年被發(fā)現(xiàn)以來經(jīng)歷了數(shù)次生物病害危機，專家們采取過多次的保護措施，但洞內(nèi)壁畫多年來卻受到不同的微生物污染，平衡狀態(tài)十分不穩(wěn)定[3]。

生物技術(shù)是新興的綜合性學科，可以為文物保護工作提供更多參考，生物學反應(yīng)特異，有針對性，對文物、操作人員和環(huán)境安全，是可持續(xù)發(fā)展的綠色策略。其應(yīng)用包括多個方面的內(nèi)容：生物檢測——檢測文物病害類型，厘清病害的產(chǎn)生機理；生物殺滅——運用天然成分殺滅有害細菌、真菌、昆蟲等；生物清洗——利用微生物代謝反應(yīng)或微生物產(chǎn)物特異地去除文物表面的污染物，而不損傷文物表面有價值的信息；生物加固——運用微生物及其產(chǎn)物進行文物加固保護處理等。

二、文物的生物學檢測技術(shù)應(yīng)用

（一）文物的生物病害

空氣中漂浮著大量的生物顆粒，以生物氣溶膠形式傳播擴散，會對人體及文物產(chǎn)生不良影響。生物氣溶膠由生物活動產(chǎn)生，由微生物或其他生物活性分子構(gòu)成，包括空氣中的細菌、塵螨、真菌、病毒、花粉、孢子等，是固態(tài)或液態(tài)的顆粒，在大氣中的數(shù)量密度在30%左右。氣溶膠里的細菌會在石質(zhì)、壁畫、木質(zhì)、紙質(zhì)、紡織品等文物表里產(chǎn)酸、產(chǎn)酶、分解纖維素及蛋白質(zhì)、染色、形成生物膜；真菌、藻類、地衣、苔蘚等會深入石質(zhì)、木質(zhì)文物基體，產(chǎn)生裂縫，產(chǎn)酸、染色；昆蟲及植物也會侵蝕文物，產(chǎn)酸及造成結(jié)構(gòu)破壞等。

文物儲存的室內(nèi)環(huán)境，或古跡建筑本身，受自身結(jié)構(gòu)和材料、空調(diào)、照明系統(tǒng)、人員流動、所在地氣候等影響，可成為微生物繁殖的良好基質(zhì)，微生物沉積繁殖，同時也對人體有影響，微生物侵染繁殖的主要參數(shù)之一是溫濕度[4][5]。

文物的一些病害如有色斑點、降解、腐蝕、孔洞等可以通過生物學方法檢測成因及狀態(tài)，方法包括顯微鏡法、分子生物學法、生物化學法等。通過這些方法，可以先清楚引發(fā)文物病害的源頭，若是生物病害，則先鑒定有害微生物，認識其理化性質(zhì)，再選用適當?shù)姆椒ㄈコ?/p>

鑒別微生物的方法有培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法，培養(yǎng)法是收集文物上的微生物樣本進行培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特性，如其生長適宜溫度及生長速率等，再分離優(yōu)勢菌株，通過基因測序分析其種屬，從而提高文物保護工作的針對性[6]。

然而實驗室可以培養(yǎng)的微生物僅占自然界種類的1%，從文物中分離培養(yǎng)的微生物或不能準確反映文物中的微生物情況，針對這點，可選用免培養(yǎng)法對文物中的微生物進行檢測。

（二）掃描電子顯微鏡分析法

用掃描電鏡觀測文物的微生物病害是免培養(yǎng)法，方法快速、直觀，能觀察到樣品的細胞水平。楊娟[7]檢測畫作表面的剝落，發(fā)現(xiàn)其中有霉菌菌絲、孢子的結(jié)構(gòu)，即使畫作表面沒有看到菌斑，也能判斷其已受霉菌侵蝕。在南海I號沉船船體發(fā)掘過程中，船木表面附著了白色污染物，通過掃描電鏡觀察，分辨出有細胞結(jié)構(gòu)的霉菌和析出的鹽分，通過木材樣品切片鏡檢，可以看到真菌菌絲已經(jīng)侵入到木射線中[8]。在小白礁I號沉船的保護工作中，通過掃描電鏡可以看到木質(zhì)文物的腐蝕狀況，侵蝕細菌的類型，細菌的附著位置，并能了解其部分生理生化特征[9]。

（三）分子生物學方法

分子生物學檢測快速、方便、精確，且優(yōu)勢越來越明顯。分子生物學法是基于基因水平的檢測，所用的方法包括或涉及聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR,Polymerase Chain Reaction)、變性梯度凝膠電泳（DGGE,denatu ring gradient gel electrophoresis)、高通量測序法（highthroughput sequencing）等。

PCR-DGGE法是PCR和DGGE的聯(lián)用，通過擴增微生物特征DNA（16sDNA、18SDNA、ITS等）中的一些片段，根據(jù)不同種屬DNA片段的分子量和電荷比的差異在凝膠電泳上將之分離，通過其條帶及亮度可得到待測樣品微生物群落組成。高通量測序法是一種DNA邊合成邊測序的手段，且隨著發(fā)展，DNA的讀長在不斷增長[10]，讀出DNA序列后可通過比對基因庫，得出樣品中各微生物的種屬，能得到樣品微生物的多樣性和豐度等參數(shù)，有助于研究群落內(nèi)部及群落與環(huán)境間的關(guān)系等。

重慶三峽博物館[11]用沉降法采集空氣微生物，提取總DNA進行PCR-DGGE檢測，選取優(yōu)勢菌種測序，得出微生物數(shù)量與季節(jié)變化相關(guān)。顏菲等[12]在云岡石窟及石窟周邊巖石取樣進行PCR-DGGE檢測，選取優(yōu)勢條帶進行測序，發(fā)現(xiàn)有些細菌會參與磷、硫、氮、碳循環(huán)，可分解空氣中的污染物，會在文物表面產(chǎn)酸，腐蝕石質(zhì)文物。Kusumi等人[13]采集了柬埔寨吳哥窟巴揚寺砂巖石質(zhì)建筑表面的有色生物膜樣品，及建筑物空氣中的微生物樣品進行PCR-DGGE檢測，發(fā)現(xiàn)空氣中微生物種類比建筑表面的少得多，采集的生物膜干濕、顏色、厚度各不相同，微生物的成分也有不同，微生物之間有寄生關(guān)系。

Michaelsen等人[14]檢測一份13世紀紙質(zhì)手稿的病害，用DGGE法及克隆文庫法檢測了真菌和細菌菌落的組成，電子顯微鏡和電子分散光譜觀察分析無機成分，得出手稿上有真菌干燥的菌絲、孢子、淀粉、纖維素、含鐵油墨、海鹽等成分，推測出手稿的保存過程中環(huán)境溫濕度有變化，曾因濕潤而導致細菌侵染繁殖，后又經(jīng)歷干燥或鹽漬環(huán)境，導致適應(yīng)該條件的微生物繁殖。

DGGE方法靈活方便，但也有局限性，跟高通量測序方法相比，DGGE法反映的物種豐度或?qū)⒈桓吖?，而多樣性或?qū)⒈坏凸繹15]。高通量測序法相比DGGE更直觀、更準確，但成本相對較高。對比兩份不同團隊[16] [17]做的南海I號沉船的木材微生物高通量測序檢測，發(fā)現(xiàn)不同時間檢測得的微生物略有不同，如在劉自軍的論文中以擴增子測序方法，檢測到2015年的木材樣品細菌以厚壁菌門為主（平均42.3%),真菌以鐮刀菌屬（F. solani和F.oxysporum)為主，這兩種鐮刀菌能降解纖維素和木質(zhì)素，因此需要重點防治；李秋霞的論文中檢測得2013年的木材樣品以變形菌門為主（52.9%）。

Meng等人[18]用高通量測序法檢測柬埔寨柏威夏神廟微生物的DNA和RNA，發(fā)現(xiàn)兩者差異較大，表明不同細菌的活性有高低差異，或檢測的RNA結(jié)果更能準確反映主導建筑物生物腐蝕的細菌類型。

免培養(yǎng)的微生物檢測方法還有實時PCR法（quantitative PCR)，Ettenauer等人通過[19]實時PCR檢測擴增微生物樣品β-肌動蛋白DNA，了解室內(nèi)隔熱材料的微生物附著生長情況，從而建議選取珍珠巖灰泥作為最合適的隔熱材料，該方法快速、靈敏。

測序技術(shù)發(fā)展迅速，成本在降低，能分析菌群與環(huán)境間、微生物群體間的相互作用，然而目前對這種相互作用的方式和機理認識還不夠充分，未來或可積累經(jīng)驗，開發(fā)出更成熟的技術(shù)方法深入了解各文物的微生物生態(tài)系統(tǒng)，從而制訂更有針對性的殺滅方法。

（四）生物化學法

生物化學法是研究生物體化學過程的方法，包括酶活性測定、ATP發(fā)光測定、生物質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)等。

酶活性測定法可以檢測紙質(zhì)文物上微生物纖維素降解、石質(zhì)文物上微生物的硫氮代謝、木乃伊或皮質(zhì)文物微生物膠原降解等的酶活性[20]。ATP發(fā)光測定法可使用ATP生物發(fā)光檢測試劑盒，或ATP熒光檢測便攜設(shè)備，確定霉斑是否有微生物活性，抑菌劑的效力測試，及藥劑殘留情況[21]，結(jié)果有參考價值，操作簡便快速。

生物質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法可用于樣品中的蛋白質(zhì)類紡織品檢測，如絲綢、動物毛類紡織品，這類紡織制品在墓葬埋藏環(huán)境容易降解，無法辨識。李力[22]、 陳華鋒[23]用生物質(zhì)譜法分析墓葬紡織痕跡土樣，得到多肽片段序列，比對蛋白庫得知其原為絲綢制品。陳華鋒的研究還用SDS-PAGE分析老化蠶絲斷裂的易發(fā)點，了解蠶絲斷裂后蛋白分子量的分布情況，建立古代蠶絲老化的評價標準，以做到針對性地選擇保護材料和保護方法，提高絲綢的保護水平。劉苗苗[24]、游秋實[25]用ELISA方法對出土泥化絲織品進行檢測，能特異地檢出樣品中含有家蠶絲織品，該方法靈敏度高，且能定量，檢出限達到ng/ml。生物化學法可以檢測文物的生物病害，也是考古研究的手段，在生物考古中有較大應(yīng)用。

三、文物的生物破壞防治方法應(yīng)用

文物外部環(huán)境中的病原生物殺滅和去除有物理法、化學法和生物法，生物殺滅主要是利用動植物、微生物等提取的天然成分對真菌、細菌、昆蟲等生物破壞進行抑制。這些天然成分需安全有效，包括從海洋無脊椎動物提取的生物活性成分[26]、微生物菌劑、植物提取的萜類、黃酮類、酚類、生物堿、香豆素、單寧、植物精油等[27]。植物精油是混合物，有抗菌防腐功能，可用于化妝品，溫和無刺激、環(huán)保[28]。天然產(chǎn)物及微生物提取物防蟲防霉在食品、生鮮、飼料行業(yè)已有相關(guān)的研究應(yīng)用，并且有些成分已開發(fā)為防腐保鮮、防霉菌劑產(chǎn)品[29]。

唐歡等人[30]在實驗層面證實 5 種植物源提取物（檸檬醛、香茅醇、芳樟醇、香茅醛、香葉油）對博物館展廳內(nèi)采集的空氣微生物有良好的抑菌效果，可應(yīng)用為博物館展廳內(nèi)的空氣微生物凈化劑。

鄭琳[31]的研究表明肉桂醛、檸檬醛、香茅醛、α-溴代肉桂醛、富馬酸二甲酯、對羥基安息香酸酯等作為揮發(fā)性防霉劑，低毒或無毒，可用于展柜等密閉空間中，但需要考慮其對文物的質(zhì)地、色澤的影響。

胡彬彬[32]的專利運用“以原溯源，以物治物”及中藥藥學原理，結(jié)合民間經(jīng)驗，開發(fā)出以多種中藥材、動植物、礦物為原料提取的有效成分，涂抹于文物表面，能清除污垢、還原色彩、防腐防蟲。

王明茲等人[33]的專利用產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株發(fā)酵液滅菌后制作成防霉菌劑，可用于處理竹木制品，能起到防腐防霉效果。

天然產(chǎn)物是抗菌藥物的來源，然而長期使用一種殺蟲劑可能會出現(xiàn)抗性、殘留、復蘇等問題。期待將來可以篩選出持久、無毒無害、廣譜、不產(chǎn)生抗藥性、綠色環(huán)保、易于提取加工的抗蟲抗菌劑。

四、文物的生物清洗方法應(yīng)用

文物的清洗方法有化學法、物理法和生物法，這些方法可以結(jié)合使用。生物清洗相對于物理、化學方法，或?qū)Σ僮鞯囊蟾?，如活菌、活性成分的提取，活性的維持等，但生物學方法作用條件溫和，底物特異，不會影響文物表面顏色，能取得非常好的清洗效果，且對于文物、環(huán)境和操作人員來說生物清洗法較為安全。

生物清洗的具體操作主要是利用微生物（細菌、真菌、古生菌）代謝活動、酶、動植物及礦物的天然提取物等來進行清洗。微生物清洗的應(yīng)用有脫硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris)、硫酸鹽還原菌（Desulfovibrio desulfuricans)、類產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes)去除石質(zhì)文物黑色硬結(jié)物、硝酸鹽和硫酸鹽，斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri)用來去除鹽風化物質(zhì)、有機物等[34] [35]。酶在清洗領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用，且歷史悠久，主要有四種類型：蛋白質(zhì)分解酶、脂肪分解酶、淀粉分解酶和纖維分解酶[36]。植物成分應(yīng)用于清洗古已有之，如皂角植物水溶液清洗衣服；利用唾液中的酶，以漱口水或者用口嚼蘿卜來清洗血污衣、油污衣和汗污衣等[37]。

為了防止過多的水分影響文物的保存，生物清洗操作一般是使用敷料包固定微生物或酶在文物表面進行濕敷。Ferrari等人[38]將淀粉酶刷在結(jié)冷膠上，再敷到拜占庭時期的束腰外衣表面，清洗前人修補時留下的老化淀粉膠。這種老化淀粉膠使織物變脆，傳統(tǒng)的蒸汽霧化加機械方法無法有效去除，而淀粉酶清洗溫度溫和、pH接近中性，效果顯著，清理后織物恢復彈性，還可以用針線進行修補。Roig等人[39]選取了一株施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri)固定在瓊脂中，清潔一座瓦倫西亞教堂13世紀的壁畫。該菌能夠把壁畫上的硝酸鹽沉積轉(zhuǎn)化成氮氣，可清除九成以上的硝酸鹽沉積，且清潔處理一個月后也沒有發(fā)現(xiàn)細菌殘留。

從海洋生物中提取的酶具有低溫活性，Palla等人[40]用海洋無脊椎動物蛋白酶清洗畫作和蠟雕塑表面的老化蛋白膠層，清除過程可在室溫（19-25℃)下進行，比傳統(tǒng)蛋白酶溫度低。且實驗還表明海洋無脊椎動物提取物還具有細菌（腸桿菌屬、藤黃球微菌）和真菌（黑曲霉、產(chǎn)青黃霉菌）的抗菌活性。

清洗紡織品文物的案例還有酶復配表面活性劑、天然產(chǎn)物、酶清洗劑去除血漬、脂肪等有機污漬，微生物菌液去除結(jié)晶鹽等[41]。

五、文物的生物加固方法應(yīng)用

（一）石質(zhì)文物的生物加固

微生物在風化石質(zhì)的加固應(yīng)用上屢見報導，這種生物方法友好、有效、有潛力[42]。無機化學材料修復石質(zhì)文物容易導致石質(zhì)孔隙堵塞，鹽結(jié)晶膨脹，加劇風化，有機材料與石質(zhì)無機材料的吸水性有差異，易導致石質(zhì)受應(yīng)力破壞。而微生物加固是利用細菌在石質(zhì)內(nèi)部，以菌體作為核點，誘導產(chǎn)生碳酸鈣晶體，其成分及晶型與基體石質(zhì)相近，并與之粘結(jié)，不堵塞石質(zhì)的孔隙[43]，細菌產(chǎn)生的碳酸鈣硬度比自然界的更大、更能抵抗腐蝕和擠壓等外界力量[44]，能用于石灰?guī)r、大理石和漢白玉等石質(zhì)文物的修復。細菌產(chǎn)碳酸鈣是廣泛存在的生物鈣循環(huán)，能產(chǎn)碳酸鈣的細菌類型有很多種。

孫延忠等人[45]篩選了一株枯草桿菌-II(Bacillus substilis)在培養(yǎng)基上誘導產(chǎn)生了碳酸鈣白色沉淀。Castanier等人[46]在12世紀的圣梅達教堂圣塔上噴涂細菌（Bacillus cereus)及其培養(yǎng)基以加固石塔，經(jīng)過一年半的觀察，發(fā)現(xiàn)微生物形成的鈣膜質(zhì)量好，穩(wěn)定性高，能對原基質(zhì)起到保護作用，此技術(shù)已用于巴黎私人建筑大面積大規(guī)模處理；Perito等人[47]為了防止修復用的微生物及培養(yǎng)基引起不良微生物的生長，用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的細胞碎片產(chǎn)碳酸鈣，修復 6 世紀的石質(zhì)紀念碑，效果理想。

（二）紡織品文物的生物加固

紡織品的保護加固方法有物理加固法、裝裱法、針線修復法，化學的膠粘劑加固法、絲蛋白加固法、生物加固法[48]。

林珍[49]利用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化人工老化脆弱羊毛織物與同源角蛋白交聯(lián)鍵接加固，觀察到羊毛織物的纖維上斷裂分子鏈的氨基酸殘基與所添加的氨基酸能發(fā)生鍵接，同時羊毛織物纖維斷裂分子鏈間或鏈內(nèi)也可能會發(fā)生重新交聯(lián)鍵接，取得良好的加固效果，并且加固處理不會對羊毛織物的外觀帶來不良影響。

吳順清等人[50]用細菌纖維素噴涂在人工老化絲織品上，發(fā)現(xiàn)細菌纖維素能連結(jié)絲纖維，起到加固作用，增強樣品拉力，且細菌纖維素在紫外及臭氧處理后能被可逆去除，可用于糟朽絲織品加固。

細菌纖維素是細菌的胞外產(chǎn)物[51]，可由多種細菌產(chǎn)生，與植物纖維素結(jié)構(gòu)有差異，其形態(tài)可隨培養(yǎng)條件控制，純度高，產(chǎn)量大，聚合度可調(diào)控，或可替代植物纖維素，以達到減少樹木砍伐的可持續(xù)綠色發(fā)展目標。細菌纖維素可用于紡織類、紙質(zhì)、木質(zhì)文物的修復加固，且已應(yīng)用在食品工業(yè)、造紙、醫(yī)學等領(lǐng)域[52] [53]。

吳順清等人的文保創(chuàng)新項目[54]利用微生物菌群轉(zhuǎn)換纖維，合成與天然絲蛋白結(jié)構(gòu)和性能相似的物質(zhì)，用于出土絲織物的加固，加固后絲綢強度增加，可任意折疊，且能避免加固材料老化，化學殘留等問題。

（三）木質(zhì)文物的生物加固

木質(zhì)文物若儲存不當，尤其是長期埋藏在水環(huán)境中的飽水木質(zhì)文物，其中起支撐結(jié)構(gòu)作用的纖維素容易被降解而強度降低、糟朽。飽水木質(zhì)文物目前主流的加固方法是化學加固法，主要加固材料是PEG、糖類、乙二醛等。

劉麓琪[55]發(fā)現(xiàn)先用木糖醇與海藻糖浸泡，再用產(chǎn)纖維素紅茶菌液共培養(yǎng)方法加固人工降解木片，細菌纖維素填補了木片表面的裂隙，木片強度加強，加固效果良好。

陳中行等人[56]的課題用微生物法處理木構(gòu)件的脫水定型，利用木醋桿菌或其他微生物將葡萄糖轉(zhuǎn)化為纖維素，從而修復補充木構(gòu)件中已經(jīng)降解損傷的纖維素，達到加固定型效果。

周松巒等人[57]將飽水木塊與醋桿菌（Acetobacter sp.)共培養(yǎng)，細菌纖維素能與植物纖維素結(jié)合，修復損傷的纖維素，木質(zhì)內(nèi)部間隙明顯變小。

生物加固的優(yōu)點是可以選用與文物同源的加固材料，或者引入微生物在文物內(nèi)部產(chǎn)生這種材料，這些加固材料能與文物自身材料交聯(lián)，相容性好，使文物強度加大，且不會引入新的污染。然而微生物誘導產(chǎn)生的加固材料結(jié)構(gòu)會隨著培養(yǎng)條件的改變而有不同，其加固修復作用的代謝反應(yīng)機理需要進一步研究，以更好地控制加固修復反應(yīng)。

六、總結(jié)

文物的生物病害檢測可運用生物學方法，還可以“對癥下藥”，用于防治微生物腐蝕、蟲害等，還可以利用微生物酶或代謝產(chǎn)物對文物表面附著物進行生物清洗，還可以運用微生物菌體或其代謝物以對脆弱文物進行加固。

本文所列的檢測方法、材料應(yīng)用是基于國內(nèi)外文獻的總結(jié)概述，但由于本人能力不足，還有許多方面需要補充，應(yīng)用于文物保護的生物學方法還有很多，且不斷有新方法應(yīng)用，新活性分子開發(fā)，且文物保護領(lǐng)域研究手段豐富，有越來越多的學科交叉協(xié)作，研究成果顯著。生物材料不易篩選，操作復雜，或需要精確的培養(yǎng)條件，有局限性，目前文保的主流仍是更加成熟和經(jīng)驗積累較多的物理、化學方法，而且不同加固方法和材料有不同的優(yōu)缺點和效果，隨著時間的推移會面臨更多新的問題和挑戰(zhàn)，需要更多人力、資金、實驗和摸索。生物學的文保方法目前大多還在實驗階段，希望將來生物學的文物保護方法會有更好的表現(xiàn)，實現(xiàn)商品化、產(chǎn)業(yè)化。