miR-200c及MALAT1在原發(fā)性不孕患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及臨床意義*

陸月梅 王秀美* 薛曉玲 周麗佳 儲巧香

原發(fā)性不孕是指未孕育過子女，且婚后有正常性生活女性在未避孕情況下1年未懷孕，原發(fā)性不孕發(fā)生影響因素有男性方面因素(如精液異常、免疫、性功能等)，也有女性方面因素(如輸卵管、子宮、陰道異常等)。由于近年來人們生活節(jié)奏加快、精神壓力增大、飲食習(xí)慣差、飲食結(jié)構(gòu)不科學(xué)等，原發(fā)性不孕發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢[1]。對原發(fā)性不孕進(jìn)展中相關(guān)因子研究，對患者病情及時評估和有效治療有重要價值。不孕癥發(fā)生發(fā)展與性激素水平變化密切相關(guān)，而microRNA-200c(miR-200c)在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[2-3]。miR-200c在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與雌激素受體(estrogen receptor，ER)和細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)[4]。乳腺癌中肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，MALAT1高表達(dá)與ER和孕激素受體(progesterone receptor，PR)水平有關(guān)[5]。前列腺癌中MALAT1能與ER、PR相互作用，共同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6]。本研究旨在通過采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)檢測原發(fā)性不孕癥患者子宮內(nèi)膜組織中miR-200c和MALAT1水平，分析二者與性激素關(guān)系，探究二者在原發(fā)性不孕癥中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2019年6月南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院收治的86例原發(fā)性不孕患者，年齡23～36歲，平均年齡(26.37±6.24)歲，將其納入原發(fā)性不孕組，另選取同期行診斷性刮宮術(shù)的86名正常生育健康女性，年齡24～35歲，平均年齡(27.04±6.01)歲，作為健康對照組。兩組年齡比較無差異。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，所有入組者及家屬均對研究知情并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)美國生殖醫(yī)學(xué)會對不孕女性診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]確診為原發(fā)性不孕；②3個月內(nèi)未用任何激素類藥物，無妊娠、哺乳和刮宮史；③子宮腔正常、輸卵管通暢。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有身體其他部位疾?。虎诰癞惓?；③丈夫精子、精液異常者。

1.3 儀器設(shè)備和試劑

采用7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；TR205-10型核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司)；15750078反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司)；RR820A型熒光定量PCR試劑盒(日本TAKARA公司)；抗體622101-1 Anti-β-actin(上海恒斐生物科技有限公司)；MA515344 Anti-ER(天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司)；MA515316 Anti-PR(天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司)。

1.4 樣本采集

原發(fā)性不孕組患者于月經(jīng)來潮24 h內(nèi)，用內(nèi)膜采集器獲取子宮內(nèi)膜組織；健康對照組在行診斷性刮宮術(shù)時收集子宮內(nèi)膜組織。所取材料一部分用于qRTPCR，另一部分用于western blot實驗。所有入組者在入組時清晨(7：00-9：00)空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血5 ml，用于激素水平測定。

1.5 檢測方法

(1)qRT-PCR法檢測子宮內(nèi)膜組織中miR-200c及MALAT1表達(dá)水平。采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄呈cDNA后-20 ℃保存，用于qRT-PCR實驗。①20 μl反應(yīng)體系：Premix Ex TaqⅡ 10 μl，cDNA模板2 μl，上、下游引物各0.8 μl，ROX DyeⅡ0.4 μl，dH2O 6 μl；②反應(yīng)步驟：95 ℃，30 s，1循環(huán)，95 ℃、5 s，63 ℃、33 s，40個循環(huán)，采用2-??CT法進(jìn)行miR-200c及MALAT1相對表達(dá)量計算，所用引物見表1。

(2)Western blot法檢測子宮內(nèi)膜組織中ER及PR蛋白表達(dá)水平。采用Western blot法檢測所有入組者子宮內(nèi)膜組織中ER和PR表達(dá)水平，以β-actin蛋白為內(nèi)參。用Quantity-One軟件收集ER、PR及β-actin條帶灰度值數(shù)據(jù)，二者與β-actin比值為各自相對表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物

1.6 血清性激素水平測定

采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測入組者血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、雌激素(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T)以及催乳素(prolactin，PRL)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS23.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料用百分比(%)表示，采用x2檢驗。采用Pearson法分析miR-200c和MALAT1與E2、P、ER及PR相關(guān)性，采用Logistic回歸模型分析原發(fā)性不孕危險因素，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

原發(fā)性不孕組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.380，t=0.433；P＞0.05)。原發(fā)性不孕組患者有避孕史、痛經(jīng)比例和有家族史比例顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=15.740，x2=14.606，x2=5.287；P＜0.05)，見表2。

表2 兩組臨床資料比較[例(%)]

2.2 兩組激素水平比較

原發(fā)性不孕組患者血清中E2、FSH、LH、T、PRL及子宮內(nèi)膜組織中ER水平顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.159，t=8.007，t=7.739，t=7.471，t=8.867，t=15.264；P＜0.05)；血清P及子宮內(nèi)膜組織中PR顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.728，t=13.961；P＜0.05)，見表3。

表3 兩組激素水平比較()

表3 兩組激素水平比較()

注：表中E2為雌激素；P為孕酮；FSH為血清促卵泡激素；LH為黃體生成素；T為睪酮 ；PRL為催乳素；ER/β-actin為雌激素受體相對表達(dá)量；PR/β-actin為孕激素受體相對表達(dá)量

2.3 兩組子宮內(nèi)膜組織中miR-200c和MALAT1表達(dá)水平比較

原發(fā)性不孕組患者子宮內(nèi)膜組織中miR-200c和MALAT1表達(dá)水平與健康對照組相比均明顯升高，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.388，t=19.543；P＜0.05)，見表4。

表4 兩組子宮內(nèi)膜組織中miR-200c和MALAT1表達(dá)水平比較

2.4 原發(fā)性不孕患者子宮內(nèi)膜組織中miR-200c和MALAT1表達(dá)水平與血清激素水平相關(guān)性

原發(fā)性不孕患者子宮內(nèi)膜組織中miR-200c和MALAT1表達(dá)水平與P水平無關(guān)，與E2、ER水平呈正相關(guān)(r=0.354，r=0.541，r=0.426，r=0.492；P＜0.05)，與PR水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.483，r=-0.395；P＜0.05)，見表5。

2.5 原發(fā)性不孕發(fā)生危險因素分析

以原發(fā)性不孕患者血清E2水平、子宮組織ER、PR、miR-200c及MALAT表達(dá)水平為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析可知，ER高水平、PR低水平、miR-200c高水平以及MALAT1高水平是原發(fā)性不孕發(fā)生危險因素(OR=2.678，OR=3.173，OR=3.282，OR=3.094；P＜0.05)，見表6。

表5 子宮內(nèi)膜組織中miR-200c和MALAT1表達(dá)水平與血清各激素水平相關(guān)性

表6 原發(fā)性不孕發(fā)生危險因素Logistic回歸分析

3 討論

有研究表明，家族史、藥流史、受孕年齡等在一定程度上影響不孕癥的發(fā)生[8-9]。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性不孕組患者有避孕史、痛經(jīng)比例和有家族史比例顯著高于健康對照組，提示有避孕史、痛經(jīng)和家族史可能與原發(fā)性不孕發(fā)生有關(guān)。原發(fā)性不孕發(fā)病機制復(fù)雜多變，如陰道、子宮和卵巢先天性發(fā)育異常，陰道、子宮和輸卵管炎癥，以及輸卵管積液，宮頸狹窄及息肉等[10]。臨床中若不能及時診斷出病因及患病程度，患者會因無法進(jìn)行有效治療而病情加重，對患者精神和生活質(zhì)量造成危害。目前不孕癥相關(guān)因子已有少量研究，但探尋更多相關(guān)生物標(biāo)志物對控制患者病情、制定有效治療方案有一定幫助。

Botelho等[11]研究證實，E2可作為感染引起的不孕癥的潛在生物標(biāo)志物。Kobayashi[12]和Dorostghoal[13]等研究表明，E2和ER刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，與子宮著床窗口關(guān)閉和子宮內(nèi)膜容受性改變有關(guān)。P水平低與不孕有關(guān)，臨床多用P輔助生殖和治療不孕癥[14]。Petousis等[15]研究報道，不明原因不孕患者子宮內(nèi)膜組織中PR表達(dá)下調(diào)，PR可能作為治療靶點以改善生殖結(jié)局。

本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性不孕患者血清中E2、ER水平明顯高于健康對照組，P、PR水平明顯低于健康對照組，提示血清E2、ER水平升高，P、PR水平降低可能與原發(fā)性不孕癥發(fā)生有關(guān)，而E2、ER、P及PR可能通過調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性，影響受孕進(jìn)展。

miRNA是一類能穩(wěn)定存在于細(xì)胞和組織中的短鏈非編碼RNA，具有調(diào)控功能，能參與多種疾病調(diào)控。原發(fā)性不孕癥與子宮內(nèi)膜異位癥密切相關(guān)，Dong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-191在子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中表達(dá)水平升高，與子宮內(nèi)膜異位癥向惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。Zhang等[17]研究證實，與健康對照組相比，輸卵管炎異位妊娠患者體內(nèi)miR-1247表達(dá)水平顯著升高，可能是異位妊娠生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，miR-200c在原發(fā)性不孕患者子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)水平顯著高于健康對照組，提示miR-200c可能與原發(fā)性不孕發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Islam等[18]在子宮平滑肌瘤研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)積累中miR-200c水平與ER、PR水平變化有關(guān)。Zheng等[19]研究報道，與健康非妊娠和早孕婦女相比，miR-200c在流產(chǎn)和不孕癥患者血清中表達(dá)水平升高，與子宮內(nèi)膜容受性降低有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性不孕患者子宮內(nèi)膜組織中miR-200c表達(dá)水平與E2、ER水平呈正相關(guān)，與血清PR水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-200c可能通過調(diào)控E2、ER及PR水平，影響子宮內(nèi)膜容受性，參與原發(fā)性不孕癥進(jìn)展。具體作用機制還需深入研究。

MALAT1是一種與腫瘤增殖、分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)的長鏈非編碼RNA。有研究報道，MALAT1在宮頸癌組織中相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖[20-21]。上皮性卵巢癌患者血漿中MALAT1表達(dá)水平顯著高于健康對照組，是患者發(fā)生腫瘤細(xì)胞低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險因素[22]。不孕癥發(fā)生與子宮內(nèi)膜增殖、著床窗口狀態(tài)和子宮容受性有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，原發(fā)性不孕癥患者子宮內(nèi)膜中MALAT1表達(dá)水平明顯升高，提示MALAT1高表達(dá)可能影響原發(fā)性不孕發(fā)生。有研究表明，MALAT1表達(dá)水平與E2、ER及PR水平有關(guān)[5-6]。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性不孕患者子宮內(nèi)膜組織中MALAT1表達(dá)水平與E2、ER水平呈正相關(guān)，與血清PR水平呈負(fù)相關(guān)，但具體機制尚需進(jìn)一步研究。MALAT1可能通過影響E2、ER及PR水平，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖，抑制子宮內(nèi)膜容受性，影響患者受孕進(jìn)程[23]。本研究還發(fā)現(xiàn)，ER高水平、PR低水平、miR-200c高水平、MALAT1高水平是原發(fā)性不孕發(fā)生危險因素，提示ER、PR、miR-200c及MALAT1均可能作為原發(fā)性不孕生物標(biāo)志物，用于評估疾病發(fā)生發(fā)展，為患者病情診斷和治療方案確定提供一定幫助。

4 結(jié)論

原發(fā)性不孕患者子宮內(nèi)膜組織中miR-200c、MALAT1表達(dá)水平明顯高于健康對照組，與E2、ER和PR水平變化有關(guān)，可能通過影響E2、ER和PR水平參與原發(fā)性不孕發(fā)生發(fā)展。但由于本研究樣本量較少，方法較為基礎(chǔ)單一，具體作用機制還需進(jìn)行大量實驗深入研究。