狗尾草葉瘟病病原的分子鑒定及其對(duì)14 種殺菌劑的敏感性測(cè)定

周鋒，范玉闖，馬亞輝，王金葉，胡明城，張明慧，翟鳳艷，劉鳴韜，張偉麗，楊蕊*

（1.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003；2.范縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 范縣 457500）

狗尾草（Setaria viridis） 又稱綠狗尾草、谷莠子，為單子葉植物綱禾本科黍亞科狗尾草屬植物，常分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1，2]。狗尾草富含酚類和多糖類物質(zhì)以及鈣和磷等礦質(zhì)元素，且具有清熱利濕、解毒等功效，是重要的中藥資源[2～6]；同時(shí)，其具有易種植、植株較矮小、生長(zhǎng)周期較短、二倍體、基因組較小、抗性基因豐富且較容易轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，是研究單子葉植物基因功能的重要模式植物[1，7～9]。但是，狗尾草由于常伴生在玉米、大豆等主要農(nóng)作物田中，因此被列為主要的農(nóng)田雜草[10]。目前，關(guān)于狗尾草病原方面的報(bào)道主要集中在鏈格孢屬（Alternaria spp.）、甘蔗平臍蠕孢菌（Bipolaris sacchari）、狗尾草平臍蠕孢（B. setariae）、間隔彎孢（Curvularia intermedia） 和嘴突凸臍蠕孢（Exserohilum rostratum） 等[10]，其他病原菌方面的研究尚未見報(bào)道；而且，對(duì)已報(bào)道的相關(guān)病原菌鑒定主要集中在形態(tài)學(xué)方面，對(duì)分子鑒定方面的內(nèi)容涉及較少。

2019 年9 月作者在河南省新鄉(xiāng)市郊區(qū)開展作物病害調(diào)研過程中發(fā)現(xiàn)，部分玉米田邊生長(zhǎng)的狗尾草葉片上存在很多形狀為梭形、長(zhǎng)橢圓形或橢圓形且邊緣呈灰白色、中央呈暗褐色的病斑（圖1），該癥狀與水稻葉瘟病比較相似[11]。為了進(jìn)一步明確該病害的病原，對(duì)病原物進(jìn)行了分離、純化以及rDNA-ITS 的分子鑒定，同時(shí)測(cè)定了病原菌對(duì)14 種殺菌劑的敏感性，以期為該病害的化學(xué)防控提供指導(dǎo)。

圖1 狗尾草葉瘟病的田間癥狀Fig.1 Field symptoms of leaf blast of green bristlegrass

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

狗尾草感病葉片，取自田間已發(fā)病的植株上。

試劑有PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂條20 g，dd H2O 定容至1 L）、2×Taq master mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司） 和DNA Marker 2000 （北京博邁德基因技術(shù)有限公司）。

殺菌劑有14 種，分別是96.0%咯菌腈原藥（湖北健源化工有限公司）、97.0%咪鮮胺原藥（湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司）、95.0%氟啶胺原藥（浙江禾本科技有限公司）、96.2%戊唑醇原藥（江蘇黃海農(nóng)藥化工有限公司）、97.5%吡唑醚菌酯原藥（湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司）、95.0%苯醚甲環(huán)唑原藥（湖北健源化工有限公司）、96.6%醚菌酯（江蘇耕耘化學(xué)有限公司）、98.0%腐霉利原藥（浙江禾益農(nóng)化有限公司）、95.0%氟吡菌酰胺原藥（湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司）、96.0%嘧菌酯原藥（江蘇耕耘化學(xué)有限公司）、97.0%啶酰菌胺原藥（湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司）、96.2%菌核凈原藥（浙江溫州農(nóng)藥廠）、98.1%嘧菌環(huán)胺原藥（湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司） 和98.1%多菌靈原藥（天津津北精細(xì)化工有限公司）。制備100 μg/mL 藥劑母液，除96.2%菌核凈原藥用甲醇（分析純） 溶解、98.1%多菌靈原藥用0.1 mmol/L 稀鹽酸溶解外，其他原藥均用丙酮（分析純） 溶解。

儀器設(shè)備有SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司）、HVA-85 型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器（日本HIRAYAMA 公司）、HP2500G 型智能光照培養(yǎng)箱（金壇市瑞華實(shí)驗(yàn)儀器廠）、BSA124S電子天平〔賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司〕、2720 型PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司），DYY-7C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）、Tanon3500核酸凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司） 和CX31-RBSFA 型生物顯微鏡（Olympus Corporation）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離 病原菌分離采用組織分離法[12]，稍有改動(dòng)。取表現(xiàn)出明顯癥狀的狗尾草葉片，在無菌條件下，將病健交界處剪成面積2～3 mm2的小塊，分別用5%次氯酸鈉溶液、70%酒精各潤(rùn)洗1 min，再用無菌水沖洗3 次，在超凈臺(tái)內(nèi)晾干后放到PDA 培養(yǎng)基中央，用封口膜封口，倒置于23 ℃普通光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。15 d 后挑選培養(yǎng)基上的孢子，在生物顯微鏡下鏡檢。其分生孢子為無色或淡褐色，洋梨形，頂部細(xì)胞立錐狀，基部細(xì)胞鈍圓，有凸起的腳胞，一般為2 個(gè)隔膜。

1.2.2 病原菌rDNA-ITS 的分子鑒定 采用羅中欽等[13]方法制備模板DNA，以ITS1 （TCCGTAGGTGAACCTGCGG） /ITS4 （TCCTCCGCTTATTGATATGC） 為 引 物〔由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成〕，對(duì)病原菌rDNA-ITS 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。50 μL PCR 反應(yīng)體系包括：2×ES taq master mix 25 μg/mL，引物Ⅰ2 μg/mL，引物Ⅱ2 μg/mL，模板5 μg/mL，dd H2O 16 μg/mL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min （循環(huán)30 次），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，備用。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。并對(duì)檢測(cè)后有明顯條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，再用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序反饋回來的序列進(jìn)行初步分析，并將其與GeneBank 中下載的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定參照室內(nèi)生長(zhǎng)速率法[14]，有改動(dòng)。在潔凈的工作臺(tái)上用無菌水稀釋母液，配制成含不同濃度藥液的PDA 培養(yǎng)基平板，其中，將多菌靈母液分別稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 和12.8 μg/mL 的溶液，其他藥劑母液均分別稀釋成0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 和0.8 μg/mL 的溶液，以加無菌水處理作為對(duì)照。在每個(gè)平板中央接入1 個(gè)直徑6 mm的新鮮菌餅，每處理均設(shè)3 次重復(fù)。在23 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取其平均值。計(jì)算生長(zhǎng)抑制率和EC50，得到毒力回歸方程。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS 軟件（專業(yè)版） 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌rDNA-ITS 序列擴(kuò)增與序列分析

對(duì)狗尾草葉瘟病菌的rDNA-ITS 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，得到了1 條明亮的條帶（圖2），測(cè)序得到長(zhǎng)度為513 bp的DNA 片段。在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，該序列與已報(bào)到菌株P(guān)yricularia oryzae （ID：JF414840.1）的序列高度相似，序列相似性為99.00%，鑒定該菌株屬無性真菌類梨孢屬成員。

2.2 殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力

圖2 狗尾草葉瘟病菌rDNA-ITS 序列擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of leaf blast pathogen of green bristlegrass

供試14 種殺菌劑中，多菌靈的EC50最高，為3.219 6 μg/mL （表1），說明狗尾草葉瘟病菌已經(jīng)對(duì)多菌靈產(chǎn)生了較低水平的抗藥性，用常規(guī)劑量已不能完全防除狗尾草葉瘟病的為害；其他13 種殺菌劑對(duì)狗尾草葉瘟病菌均具有較高活性，EC50為0.006 7～0.655 9 μg/mL，抑菌活性順序?yàn)猷拙h(huán)胺＞咯菌腈＞咪鮮胺＞氟碇胺＞戊唑醇＞吡唑醚菌酯＞苯醚甲環(huán)唑＞醚菌酯＞腐霉利＞氟吡菌酰胺＞嘧菌酯＞啶酰菌胺＞菌核凈，表明這13 種殺菌劑均可以作為化學(xué)防治狗尾草葉瘟病病菌的候選藥劑，其中嘧菌環(huán)胺的抑菌活性最高、菌核凈的相對(duì)抑菌活性較弱。

3 結(jié)論與討論

通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)分離到的狗尾草葉瘟病菌進(jìn)行了rDNA-ITS 分子鑒定，結(jié)果表明，病原菌為P.grisea，該結(jié)果與水稻稻瘟病的無性病原[11]一致。盡管狗尾草在田間一般作為農(nóng)田雜草，但是由于該病原菌也可以為害包括水稻在內(nèi)的作物而引起作物葉瘟病的發(fā)生，且該病原可以在病殘?bào)w上越冬，所以該病害一旦發(fā)生，也同樣需要控制，否則將會(huì)為來年初侵染積累充足菌源，造成作物葉瘟病的大面積流行。

表1 14 種殺菌劑對(duì)狗尾草葉瘟病菌的室內(nèi)毒力Table 1 Laboratory virulence of 14 fungicides against P. oryzae

目前，關(guān)于狗尾草葉瘟病的化學(xué)防治尚未見報(bào)道，僅有草坪葉瘟病化學(xué)藥劑田間防效的報(bào)道[15]，且關(guān)于狗尾草葉瘟病化學(xué)防治藥劑篩選方面的研究亦尚未見報(bào)道。測(cè)定該病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性，進(jìn)而篩選出對(duì)其具有較高活性的殺菌劑，并將其應(yīng)用于對(duì)狗尾草葉瘟病的防控已十分迫切。本研究通過室內(nèi)分離得到了狗尾草葉瘟病菌株，并通過菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了14 種殺菌劑對(duì)狗尾草葉瘟病的毒力，結(jié)果顯示，狗尾草葉瘟病除對(duì)苯并咪唑類殺菌劑多菌靈已產(chǎn)生較低水平的抗藥性（EC50為3.219 6μg/mL） 外，對(duì)其他13 種殺菌劑均具有較高的敏感性，EC50為0.006 7～0.655 9 μg/mL。這13 種殺菌劑均可以作為化學(xué)防治狗尾草葉瘟病的候選藥劑，但需要通過田間藥效試驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步明確其施用方式和使用劑量。