原發(fā)性硬化性膽管炎動物模型的研究進展

劉雨蓓 林以寧（通訊作者）

（中國藥科大學中藥學院 江蘇 南京 210039）

原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）是一種慢性的膽汁淤積性肝臟疾病，以肝內外膽管彌漫性炎癥和纖維化所致的多灶性膽管狹窄為主要特征，最終導致膽管阻塞、膽汁淤積性肝硬化、肝衰竭[1]。患者在任何年齡段均可能發(fā)病，診斷時年齡多在30 ～40 歲，大部分患者同時合并炎癥性腸病，且膽管癌等惡性腫瘤發(fā)生風險顯著增加[2]。目前PSC 的發(fā)病機制尚不清楚，除了晚期肝移植外，缺乏有效的治療藥物，因此建立相應的動物模型對于深入研究PSC 具有重要意義。前期人們對膽汁淤積癥的認識主要依賴于對嚙齒類動物進行膽管結扎的實驗模型，近年來通過基因調控、化學誘導等方法，已建立了多種膽管損傷的動物模型。本文對PSC動物模型的研究進展進行綜述。

1.基因敲除方法

1.1 Mdr2 基因敲除

ABCB4 基因，又稱為多藥耐藥3 基因（MDR3），主要負責調節(jié)磷脂的轉運，其在小鼠的同源基因為Mdr2，是ATP 結合轉運體超家族成員之一。在生理條件下，膽道磷脂通過Mdr2進入膽汁，形成混合的磷脂膽汁酸膠束，從而保護膽管細胞免受膽汁酸誘導的損傷。當Mdr2 基因突變時，膽汁中磷脂分泌減少，游離非膠束膽汁酸的濃度增加，隨后會導致膽管上皮細胞損傷，膽管纖維化，最終形成硬化性膽管炎[3]。該模型的主要優(yōu)點是其重現性高，易于操作，為研究旨在調節(jié)膽汁分泌和成分的新型PSC治療策略提供了機會。Fickert 等[4]證明了24-去甲熊去氧膽酸（norUDCA）在Mdr2 敲除小鼠硬化性膽管炎的治療效果方面，優(yōu)于熊去氧膽酸（UDCA）。Fuchs C D 等[5]證明了膽汁酸螯合劑通過改變肝和膽道的膽汁酸成分，使其更具親水性，從而減輕Mdr2 敲除小鼠膽汁淤積性肝膽損傷。

1.2 鐵螯合酶基因敲除（fch/fch）

紅細胞生成性原卟啉病是一種遺傳性血紅蛋白合成疾病，由鐵螯合酶的一個等位基因突變引起?；颊哞F螯合酶的活性降低，導致紅細胞和肝臟中疏水性原卟啉沉積，通過分泌進入膽汁并隨糞便排出體外。Tutois 等[6]建立了fch/fch 動物模型，造模小鼠出現皮膚病變、黃疸和嚴重的肝功能障礙，其明顯特征是肝臟、脾臟和腎臟中鐵螯合酶活性降低，膽汁中膽汁酸鹽和原卟啉的濃度升高，形成的細胞毒性膽汁可通過損傷膽管上皮而導致膽道纖維化，這與Mdr2 敲除小鼠病理情況類似，鐵螯合酶缺陷的小鼠在3 個月內會發(fā)生嚴重的肝纖維化并發(fā)展為肝硬化。

1.3 CFTR 基因敲除

囊性纖維化跨膜轉運調節(jié)體（CFTR）是ATP 結合轉運體超家族成員之一，在肝膽系統(tǒng)中CFTR 位于膽管和膽囊上皮細胞內膜頂端，其功能障礙可導致膽小管內的氯離子分泌減少，膽汁黏稠和酸化，有毒膽汁酸積蓄，濃縮分泌物的形成會引發(fā)肝內膽管阻塞和膽汁淤積。肝細胞和膽管細胞受損，單核細胞趨化因子釋放并作用于肝星狀細胞，同時膽管上皮細胞釋放細胞因子如轉化生長因子β，最終導致膽管增生，肝纖維化[7]。Durie P R 等[8]建立了Cftr-/-動物模型，模型組小鼠表現為進行性肝病，并伴有局灶性膽管炎、濃縮分泌物和膽管增生，長期可發(fā)展為肝硬化。

2.化學誘導方法

2.1 用DDC 喂養(yǎng)小鼠模型

DDC（3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶）是一種誘導慢性肝炎的致毒劑，是經典的化學染毒造模方法，DDC 給藥可刺激卟啉分泌，導致小膽管內堵塞形成。其病理表現具有人類PSC 的幾個關鍵特征，如膽管周圍纖維組織增生，呈同心圓性洋蔥皮樣纖維化，匯管區(qū)炎癥以及節(jié)段性膽管梗阻[9]。Fickert 等[10]采用0.1% DDC 飲食喂養(yǎng)雄性白化病小鼠，4 周實驗后小鼠血清生化指標顯著升高，谷胱甘肽排泄減少，出現膽管阻塞。8周后小鼠膽道卟啉分泌增加，DDC誘導骨橋蛋白的表達，提示小鼠膽管損傷和纖維化。林韓特等[11]研究非諾貝特對DDC誘導PSC小鼠的預防作用及機制，實驗中模型組小鼠肝腫脹淤血，膽汁淤積顏色深；肝組織內大面積細胞染色加深，呈嗜酸性病變，膽管周圍可見大量炎癥細胞浸潤，肝細胞局灶性壞死，提示DDC誘導PSC 模型成功。該模型發(fā)展緩慢，成本較低，對于研究外源性因素誘導的慢性膽管病機制很有價值。

2.2 用TNBS 喂養(yǎng)大鼠模型

TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）作為半抗原引起細胞介導的免疫反應，與腸上皮細胞膜蛋白的賴氨酸基團有很強的親和力[12]。自90 年代初以來，TNBS 被認為是腸透壁炎癥的有效誘導因子，被用作克羅恩病的模型。后來研究發(fā)現[13]在大鼠中單次注射TNBS 可導致血清膽汁淤積指數（堿性磷酸酶和總膽紅素）顯著升高，并使炎性細胞浸潤門管區(qū)和膽管周圍，提示膽管周炎。TNBS 模型顯示一些特性與PSC 一致，包括膽管不規(guī)則，肝內外膽管彌漫性局灶性結構，導管增生和纖維化，由巨噬細胞和T淋巴細胞引起的單核細胞浸潤。該模型的一個主要限制是由并發(fā)癥引起的高死亡率。

2.3 用LCA 喂養(yǎng)小鼠模型

石膽酸（LCA）是一種單羥基膽汁酸，具有肝毒性，其誘導膽汁淤積可用多種機制來解釋，包括短時間內給予大量LCA 會影響肝細胞膜的通透性，引發(fā)炎癥反應；以及LCA 的低溶解度所導致膽管中結晶栓的形成。Fickert 等[14]證明了給小鼠喂食疏水性LCA可在幾天內誘導膽管炎的發(fā)生。組織學上表現為，肝細胞水腫，中性粒細胞浸潤，局部膽管阻塞和導管周纖維化。由于動物在長期內不能耐受這種飲食，該模型不適合研究膽道損傷的慢性演變。

3.其他模型

PSC 的一個獨特臨床特征是它與炎癥性腸?。↖BD）的關系，主要是潰瘍性結腸炎，二者之間的聯(lián)系引起了人們對腸道菌群的關注。早期理論認為腸道微生物群在腸炎的病因中起著核心作用，也可能成為PSC 的發(fā)病機制之一，腸道細菌產生的毒性物質可能會促進膽道的炎癥。Yamada S 等[15]對結腸炎大鼠的直腸灌注大腸桿菌趨化性多肽，經直腸給藥幾天后，可見門管區(qū)明顯炎癥，肝細胞輕度壞死，誘導膽管炎的發(fā)生。該模型主要是淋巴細胞對小膽管的浸潤，提示大腸桿菌產生的趨化多肽在小膽管炎的發(fā)病機制中可能有重要作用。

4.結語

PSC 的病理過程是漸進的，絕大多數患者都是從膽管纖維化逐漸演變?yōu)楦斡不?，最終發(fā)展為末期肝病。目前尚無有效的治療藥物，動物模型的建立為研究其發(fā)病機制奠定了基礎，為藥物研發(fā)創(chuàng)造了更多可能性。無論是基因修飾型還是化學誘導型動物模型，均和人類PSC 在組織學和免疫學上有很多相似之處，但是動物模型本身具有局限性，不可避免會出現疾病以外的并發(fā)癥。不同模型各有優(yōu)劣，在具體實驗中應根據不同的研究目的來選擇適當的模型。對于PSC 動物模型還有待進一步研究，建立一個成本低、重現性好、操作簡單的實驗模型是研究人員追求的目標。