• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)及其有效成分的測(cè)定

    2020-12-04 03:10:20李文杰李美陽(yáng)
    核農(nóng)學(xué)報(bào) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:不定根鹽濃度蔗糖

    李文杰 宮 惠 李美陽(yáng)

    (延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

    歐洲纈草(ValerianaofficinalisL.)屬于敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(Valeriana)多年生草本植物,以根和根莖入藥[1],具有鎮(zhèn)靜安神、解痙止痛的功效,多用于治療神經(jīng)衰弱、失眠、癲癇等病癥[2]?,F(xiàn)代藥理研究表明,纈草三酯類(環(huán)烯醚萜酯類)成分是纈草鎮(zhèn)靜止痛的主要活性成分[3],同時(shí)還具有抗腫瘤、抗氧化和舒張血管活性的作用[4]。近年來,人們對(duì)纈草提取物及其制劑的需求日益增加,纈草活性成分的開發(fā)前景十分廣闊。但該屬植物自然生長(zhǎng)十分緩慢,野生資源急劇下降,人工栽培緩慢,優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的遺傳穩(wěn)定性難以保持[5]。另外,纈草活性成分含量很低,提取成本高,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,化學(xué)合成尚不成功[6],極大限制了其市場(chǎng)開發(fā)與應(yīng)用。因此,解決纈草三酯類活性化合物的藥源問題十分必要。

    國(guó)內(nèi)外研究表明,許多物種的不定根可以穩(wěn)定合成次生代謝物質(zhì),且已在何首烏[5]等藥用植物中成功應(yīng)用。纈草三酯類有效成分主要存在于纈草根和根莖中,因此,采用組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合誘導(dǎo)調(diào)控手段大量繁殖纈草不定根,獲得大量有效成分,是解決纈草資源開發(fā)和纈草提取物及其制劑供應(yīng)不足等問題的有效手段。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后開展了纈草有效成分分析和組織培養(yǎng)方面的研究,但大多集中于纈草屬某品種的成分分析或纈草愈傷組織誘導(dǎo)和組培快繁類研究[7],對(duì)纈草不定根培養(yǎng)的研究很少,需要纈草不定根培養(yǎng)和有效成分測(cè)定方面的研究。

    前期已經(jīng)篩選得到不定根懸浮培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基為根培養(yǎng)基(root culture medium, RCM)以及理想生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度為0.5 mg·L-1萘乙酸(1-Naph thalene acetic acid, NAA)[8]。在此基礎(chǔ)上,本研究以歐洲纈草不定根為試驗(yàn)材料,進(jìn)一步分析pH值、碳源種類、糖濃度、鹽濃度、總氮(N)濃度、總磷(P)濃度等因素對(duì)不定根懸浮培養(yǎng)的影響,確定不定根懸浮培養(yǎng)條件,同時(shí)考察此條件下不定根的生長(zhǎng)情況以及正常不定根、褐化不定根和無菌苗根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸等成分的含量,以期為纈草有效成分的規(guī)?;a(chǎn)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    歐洲纈草種子購(gòu)自美國(guó)猶他州立大學(xué)農(nóng)學(xué)院,其開花植株經(jīng)延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院全雪麗教授鑒定為敗醬科纈草屬歐洲纈草(V.officinalis)。懸浮培養(yǎng)試驗(yàn)材料為RCM+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)液中多次懸浮繼代培養(yǎng)的不定根,不定根由歐洲纈草種子繁殖的無菌苗莖段誘導(dǎo)而來;有效成分含量測(cè)定的試驗(yàn)材料為經(jīng)低溫干燥的歐洲纈草正常不定根(培養(yǎng)28 d的不定根)、褐化不定根(培養(yǎng)70 d未繼代的不定根)和培養(yǎng)2個(gè)月的無菌苗根。

    RCM培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室配制(見附表1);纈草三酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):wkq19012404,純度≥98%)購(gòu)自四川維克奇生物;乙酰纈草三酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):wkq19012505,純度≥98%)購(gòu)自四川維克奇生物;纈草烯酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):Z12J10H78323,純度≥98%)購(gòu)自上海源葉生物;乙腈(色譜純)和甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    Agilent 1260型高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái),上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Centrifuge 5804R 臺(tái)式冷凍離心機(jī),德國(guó)艾本德公司;JYD-650L超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),上海之信儀器有限公司;KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;PURELAB claffic 超純水器,英國(guó)埃爾格公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 pH值對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 以RCM為基本培養(yǎng)基,設(shè)置4種不同pH值,分別為4.5、5.0、5.7、6.5,并制作培養(yǎng)液(不加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)。每個(gè)50 mL三角瓶中加入30 mL培養(yǎng)液,121℃高溫高壓滅菌15 min備用。選取粗細(xì)均勻的不定根,將其從根尖部位切取1 cm,接種到含有配制好培養(yǎng)液的三角瓶中,每種處理設(shè)10次重復(fù)。接種前后稱量培養(yǎng)基總重量,計(jì)算接種量,接種后移至100 r·min-1搖床培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為25±2℃,暗培養(yǎng)30 d后收獲。收獲后分別稱量不定根的鮮重和干重,并計(jì)算干物率和增殖倍數(shù):

    接種量(g·L-1)=接種后培養(yǎng)基總重量-接種前培養(yǎng)基總重量

    (1)

    干物率=收獲干重/收獲鮮重×100%

    (2)

    (3)

    收獲量:將培養(yǎng)的不定根取出,用濾紙吸干水分,置于分析天平稱重,即為收獲量。

    1.3.2 碳源種類對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.1試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,用果糖、麥芽糖、葡萄糖、半乳糖4種碳源分別取代蔗糖,添加量均為30 g·L-1,配制培養(yǎng)液,滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

    1.3.3 蔗糖濃度對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.2試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,分別配制10、20、30、40、50、60 g·L-16種蔗糖濃度的培養(yǎng)液,滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

    1.3.4 鹽濃度培養(yǎng)對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.3試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,設(shè)1/2X、3/4X、X、2X、3X(設(shè)原RCM大量元素的鹽濃度為X)5種鹽濃度,配制培養(yǎng)液,滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

    1.3.5 總N濃度對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.4試驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)0、16.15、32.31、48.46、64.61、96.93 mmol·L-16種總N濃度,配制培養(yǎng)液,滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

    1.3.6 總P濃度對(duì)歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的影響 在1.3.5試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,設(shè)0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mmol·L-17種總P濃度,配制培養(yǎng)液,滅菌后備用。其他操作同1.3.1。

    1.3.7 懸浮培養(yǎng)條件下歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)情況 以RCM為基本培養(yǎng)基,將上述篩選所得最優(yōu)培養(yǎng)條件綜合,并添加0.5 mg·L-1NAA,配制培養(yǎng)液,滅菌后備用。選取粗細(xì)均勻的不定根,接種于三角瓶中,保證每瓶接種量相同,每個(gè)處理設(shè)30次重復(fù)。接種后移至搖床培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為100 r·min-1,培養(yǎng)溫度為25±2℃,暗培養(yǎng),每隔7 d取樣一次,每次取樣5瓶。參照1.3.1測(cè)定收獲不定根的鮮重作為生物量,并繪制不定根的生長(zhǎng)曲線。

    1.3.8 歐洲纈草不定根中有效成分的測(cè)定 供試品溶液制備:低溫干燥的歐洲纈草藥材粉碎過60目篩,分別稱量1.00 g正常不定根、0.23 g褐化不定根、0.27 g 2個(gè)月無菌苗根,然后依次加入25、10、10 mL甲醇,稱重后,分別超聲(500 W,25 kHz)處理40 min,再稱重,用甲醇補(bǔ)足減失重量,搖勻后離心20 min,保留上層清液。上層清液過0.22 μm有機(jī)濾膜,作為供試品溶液。

    標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備:稱取20 mg纈草三酯標(biāo)準(zhǔn)品、10 mg纈草烯酸,分別加入80 mL甲醇制成濃度為0.250、0.125 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;稱取3 mg乙酰纈草三酯,加入20 mL甲醇,制成濃度為0.150 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

    有效成分測(cè)定參考侯文慧等[9]的方法,并根據(jù)實(shí)際情況略作修改。

    色譜條件:Agilent ZRBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm,美國(guó)安捷倫公司);流動(dòng)相為乙腈-水(8∶2),等度洗脫20 min,流速1 mL·min-1,柱溫25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm,進(jìn)樣量10 μL。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    采用WPS 2019整理試驗(yàn)數(shù)據(jù),用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差和差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)pH值的篩選

    由表1可知,隨著pH值的升高,歐洲纈草不定根收獲鮮重先升高后降低,當(dāng)pH值為5.7時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛,收獲鮮重達(dá)1.88 g·L-1,增殖倍數(shù)為7.91,收獲干重為0.27 g·L-1,干物率為14.31%,且其收獲鮮重、干重顯著高于其他pH值,說明適宜歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的pH值為5.7。

    表1 懸浮培養(yǎng)下pH值對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of pH on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

    2.2 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)碳源的篩選

    由表2可知,碳源為蔗糖時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛,收獲鮮重為4.32 g·L-1,收獲干重為0.89 g·L-1, 增殖倍數(shù)為12.64,干物率為19.00%,均顯著高于其他碳源。此外,以果糖和半乳糖為碳源的懸浮液中歐洲纈草不定根幾乎不生長(zhǎng)。綜合分析,蔗糖是歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的適宜碳源。

    表2 懸浮培養(yǎng)下碳源對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of carbon sources on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

    2.3 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)糖濃度的篩選

    由表3可知,隨著蔗糖濃度的增加,歐洲纈草不定根的收獲鮮重先增加后減少,當(dāng)蔗糖濃度為40 g·L-1時(shí),不定根生長(zhǎng)最旺盛,收獲鮮重為7.68 g·L-1,收獲干重為1.73 g·L-1,增殖倍數(shù)為26.72,干物率為22.69%,除干物率外,其他指標(biāo)均顯著高于其他蔗糖濃度。蔗糖濃度為50、60 g·L-1時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)次之。因此,歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的適宜蔗糖濃度為40 g·L-1。

    表3 懸浮培養(yǎng)下蔗糖濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of sucrose concentration on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

    2.4 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)鹽濃度的篩選

    由表4可知,隨著鹽濃度的增加,歐洲纈草不定根的鮮重呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)鹽濃度為2X時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛,收獲鮮重為1.92 g·L-1, 收獲干重為0.30 g·L-1,增殖倍數(shù)為7.39,干物率為15.64%,其中收獲鮮重與干重均顯著高于其他鹽濃度。鹽濃度為X時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)次之。因此,歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的適宜鹽濃度為2倍RCM基礎(chǔ)大量元素。

    表4 懸浮培養(yǎng)下鹽濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of salt concentration on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

    2.5 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)總N濃度的篩選

    由表5可知,隨著總N濃度的增加,歐洲纈草不定根的鮮重呈先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)總N濃度為48.46 mmol·L-1時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)最旺盛,收獲鮮重為7.68 g·L-1,收獲干重為0.49 g·L-1,增殖倍數(shù)為7.52,干物率為22.03%,各指標(biāo)顯著高于其他總N濃度組。因此,適宜歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的總N濃度為48.46 mmol·L-1。

    2.6 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)總P濃度的篩選

    不定根在不同總P濃度的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)30 d后(表6),隨著總P濃度的增加,不定根的鮮重先增加后降低,在總P濃度為1.5 mmol·L-1時(shí),不定根生長(zhǎng)最旺盛,收獲鮮重為4.76 g·L-1, 收獲干重為0.89 g·L-1, 增殖倍數(shù)為18.37,干物率為18.74%,除干物率外,其他指標(biāo)物均顯著高于其他處理。因此,適于歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的總P濃度為1.5 mmol·L-1。

    表5 懸浮培養(yǎng)下總N濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 5 Effect of total N concentration on adventitious roots growth of V. officinalis under suspension culture

    表6 懸浮培養(yǎng)下總P濃度對(duì)歐洲纈草不定根生長(zhǎng)的影響Table 6 Effect of total P concentration on adventitious roots growth of Ⅴ. officinalis under suspension culture

    注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.圖1 懸浮培養(yǎng)下歐洲纈草不定根生長(zhǎng)曲線Fig.1 Adventitious root growth curve of V. officinalis under suspension culture

    2.7 懸浮培養(yǎng)條件下歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)

    由圖1可知,懸浮條件下歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)曲線基本呈“S”型。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),歐洲纈草不定根生物量先增加后小幅度減少,在接種后0~7 d不定根生長(zhǎng)基本處于遲緩期,生物量增加緩慢(圖2-A);接種后7 d,歐洲纈草不定根分化出小側(cè)根(圖2-B),其生物量開始較快增長(zhǎng);接種后7~21 d,歐洲纈草不定根增長(zhǎng)速度快,基本處于對(duì)數(shù)期(圖2-C、D);接種后21~28 d,歐洲纈草不定根增長(zhǎng)速度下降,處于緩慢增長(zhǎng)期,接種后28 d,歐洲纈草不定根生長(zhǎng)量最大,處于基本穩(wěn)定期(圖2-E);接種后28~35 d,歐洲纈草不定根生物量有小幅度下降,處于衰退期(圖2-F)。因此,接種后7~28 d為歐洲纈草不定根生物量增加的關(guān)鍵時(shí)期,接種28 d時(shí)歐洲纈草不定根生物量最大,此時(shí)適宜收獲。

    2.8 歐洲纈草的有效成分測(cè)定

    2.8.1 歐洲纈草不定根中有效成分的HPLC圖 根據(jù)1.3.8色譜條件測(cè)得3種標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間的先后順序?yàn)橐阴@i草三酯、纈草三酯、纈草烯酸(圖3-A),同時(shí)歐洲纈草不定根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸與其他組分均能達(dá)到較好分離(圖3-B)。

    2.8.2 回歸方程 以峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(x,μg)為橫坐標(biāo),得到3種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表7),3種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    表7 歐洲纈草有效成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 7 Regression equations and correlation coefficients secondary metabolites of Ⅴ. officinalis

    2.8.3 歐洲纈草有效成分含量分析 懸浮條件下培養(yǎng)的歐洲纈草3種類型根中有效成分的總含量表現(xiàn)為正常不定根>褐化不定根>無菌苗根,褐化現(xiàn)象顯著降低了不定根中有效成分的含量,其中,正常不定根中纈草三酯含量最高,為7.222 mg·g-1,無菌苗根中纈草三酯含量最低,為2.688 mg·g-1;正常不定根中乙酰纈草三酯含量最高,為0.355 mg·g-1,褐化不定根中乙酰纈草三酯含量最低,為0.036 mg·g-1;正常不定根中纈草烯酸含量最高,為4.016 mg·g-1,無菌苗根中纈草烯酸含量最低,為1.393 mg·g-1。歐洲纈草正常不定根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸含量均顯著高于褐化不定根和無菌苗根。綜上表明,在懸浮培養(yǎng)條件下大量培養(yǎng)正常不定根是高效繁殖歐洲纈草有效成分的有效手段。

    表8 歐洲纈草三種根類型有效成分的含量Table 8 Content of active ingredients of three root types of V. officinalis /(mg·g-1)

    3 討論

    3.1 歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)體系

    通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時(shí),如何提高培養(yǎng)物的增長(zhǎng)量和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量是首要解決的問題[10]。不同的培養(yǎng)基中含有不同濃度的碳源、無機(jī)鹽、維生素和有機(jī)酸等物質(zhì),這些因素會(huì)影響培養(yǎng)物生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成效果。

    不同的植物、器官或組織對(duì)培養(yǎng)基pH值的要求也不盡相同。不同植物、器官或組織生長(zhǎng)都有其最適pH值。本研究中,歐洲纈草不定根懸浮培養(yǎng)的最適pH值為5.7。曲偉紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)瓦松愈傷組織培養(yǎng)的適宜pH值為5.8,與本研究的結(jié)果相似。魏振園等[12]研究發(fā)現(xiàn)pH值為6.6左右時(shí),國(guó)槐懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好,且細(xì)胞黃酮類化合物含量較高,這與本研究結(jié)果不同。

    不同植物有不同的適合碳源,不同的碳源會(huì)對(duì)生長(zhǎng)效果產(chǎn)生不同影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明,以蔗糖為碳源時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好,生物量最大,而歐洲纈草不定根在果糖和半乳糖中幾乎不生長(zhǎng)。類似的現(xiàn)象在雷公藤[13]、檉柳[14]和蕎麥[15]等植物中也存在,可能是不定根不能直接吸收果糖和半乳糖。一般認(rèn)為,蔗糖作為很好的碳源,是由于蔗糖更容易被植物細(xì)胞壁內(nèi)的蔗糖酶分解為葡萄糖和果糖,進(jìn)而被細(xì)胞吸收和利用[13]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),蔗糖濃度為40 g·L-1時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好,生物量最大。尹雙雙[16]研究發(fā)現(xiàn)在4%蔗糖濃度下,太子參不定根生長(zhǎng)最好;Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn)在3%蔗糖濃度下,匙羹藤生物量最大;黃韜等[18]研究發(fā)現(xiàn)40 g·L-1的蔗糖濃度最有益于人參不定根的生長(zhǎng),低于或者高于此蔗糖濃度對(duì)不定根的生長(zhǎng)差。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

    鹽濃度對(duì)不定根生物量的增加及其次生代謝產(chǎn)物的合成具有很大的影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在鹽濃度為2X(即2倍的RCM大量元素)時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好,生物量最大。在低鹽濃度下,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠,導(dǎo)致了不定根生長(zhǎng)較差,生物量低,但鹽濃度超過2X時(shí),會(huì)抑制不定根生長(zhǎng),可能是滲透壓過高抑制了細(xì)胞對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收,影響了細(xì)胞生長(zhǎng)。尹雙雙[16]研究發(fā)現(xiàn),太子參不定根在1 MS鹽強(qiáng)度下生物量最大;Baque等[19]發(fā)現(xiàn)低鹽濃度最適宜諾麗果不定根生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物積累;Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)杠柳不定根在1/2 MS條件下不定根的生物量達(dá)到最大。這些研究均表明鹽濃度會(huì)影響不定根的生長(zhǎng)。

    N不僅是植物體必需的營(yíng)養(yǎng)元素,還是構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸等多種具有重要生理功能物質(zhì)的主要成分。培養(yǎng)基中N不可缺少,但N濃度過高和過低都不利于其增殖生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成。本試驗(yàn)結(jié)果表明,總N濃度為48.46 mmol·L-1時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好,生物量最大。氮源濃度在細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物合成上起著關(guān)鍵的作用[21]。吳春華等[22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基氮濃度為45 mmol·L-1時(shí),白色紫錐菊不定根生物量、酚和黃酮含量均達(dá)到最大值。李慧娟[23]發(fā)現(xiàn)東北刺人參不定根生長(zhǎng)的最適N濃度為60 mmol·L-1。

    磷是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一,也是植物新陳代謝最重要的礦質(zhì)元素之一,在植物生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物積累中起著至關(guān)重要的作用[24]。本研究中,總P濃度為1.5 mmol·L-1時(shí),歐洲纈草不定根生長(zhǎng)效果最好,生物量最大,顯著優(yōu)于其他總P濃度。李慧娟[23]發(fā)現(xiàn)1.5 mmol·L-1的P濃度可以使東北刺人參生物量達(dá)到最大值;王洪秋[25]發(fā)現(xiàn)1.88 mmol·L-1的P濃度最適宜白色紫雛菊不定根生物量積累。

    本試驗(yàn)獲得的歐洲纈草理想懸浮培養(yǎng)體系:2倍大量元素濃度、48.46 mmol·L-1總N濃度、1.5 mmol·L-1總P濃度的RCM培養(yǎng)基,添加40 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA,pH值5.7,于25±2℃、100 r·min-1條件下暗培養(yǎng)時(shí),歐洲纈草不定根的生長(zhǎng)曲線基本呈“S”型,接種后7~28 d為其生物量積累的關(guān)鍵時(shí)期,宜于接種后28 d收獲。這與尹雙雙[16]、史昆等[26]的研究結(jié)果相似。

    3.2 歐洲纈草次生代謝產(chǎn)物含量

    本研究利用HPLC測(cè)定了歐洲纈草理想懸浮培養(yǎng)條件下正常不定根、褐化不定根和無菌苗根中纈草三酯、乙酰纈草三酯、纈草烯酸的含量,發(fā)現(xiàn)正常不定根中3種有效成分含量最多,褐化不定根中成分含量嚴(yán)重降低,且顯著低于正常不定根,無菌苗根中成分含量最低。本研究中,接種后28 d,歐洲纈草不定根纈草烯酸含量為4.012 mg·g-1,高于梁朝鋒等[27]測(cè)得的黑龍江產(chǎn)黑水纈草根及根莖的中的含量,推斷對(duì)于歐洲纈草來說,給予充足的養(yǎng)分、適宜的條件,容易促進(jìn)纈草烯酸的合成和積累,這可能是由于液體培養(yǎng)中某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)促進(jìn)纈草烯酸的合成,而土壤中具有促進(jìn)作用的物質(zhì)含量較低,導(dǎo)致纈草烯酸含量較低,養(yǎng)分充足生長(zhǎng)時(shí)間短的不定根中纈草烯酸含量高于兩年生根,養(yǎng)分充足生長(zhǎng)時(shí)間短的無菌苗根中纈草烯酸含量也接近于兩年生根,這也間接證明了此推斷;不定根中纈草三酯含量為7.222 mg·g-1,高于梁朝鋒等[27]測(cè)得的黑龍江產(chǎn)黑水纈草和侯文慧等[9]測(cè)得的云南師宗和大理等地產(chǎn)蜘蛛香中的含量,低于狄宏曄等[28]測(cè)得的云南師宗地產(chǎn)蜘蛛香藥材的含量,可見同一品種、同一產(chǎn)地因儲(chǔ)藏時(shí)間過長(zhǎng)而使得纈草三酯類成分含量大幅降低,纈草三酯成分的不穩(wěn)定和易降解特性顯現(xiàn)[29];不定根乙酰纈草三酯含量為0.355 mg·g-1,高于侯文慧等[9]測(cè)得的云南永平、昆明、四川雅安、峨眉山等地產(chǎn)蜘蛛香藥材中的含量,低于云南師宗、大理和寶山等地產(chǎn)蜘蛛香藥材的含量。可見,產(chǎn)地、氣候環(huán)境、儲(chǔ)存時(shí)間、種間差異等因素會(huì)使纈草三酯、纈草烯酸、乙酰纈草三酯等成分的含量有所不同。此外,在本試驗(yàn)過程中甲醇根粉末溶液的超聲波細(xì)胞粉碎處理會(huì)使溶液溫度升高,有效成分降解,離心取上清液后的殘留物中也會(huì)存在一些有效成分,這些都會(huì)使得試驗(yàn)測(cè)量的有效成分含量值低于實(shí)際值。

    4 結(jié)論

    本研究篩選到的歐洲纈草理想懸浮培養(yǎng)條件為2倍RCM大量元素濃度、48.46 mmol·L-1總N濃度、1.5 mmol·L-1總P濃度的RCM培養(yǎng)基,添加40 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA,pH值5.7,此條件下接種后培養(yǎng)28 d,收獲得到的歐洲纈草不定根中纈草三酯、乙酰纈草三酯分別為7.222、0.355 mg·g-1,2種有效成分總含量為7.577 mg·g-1,約占不定根總干重的0.76%,與2010版中國(guó)藥典規(guī)定的蜘蛛香藥材干燥品中纈草三酯和乙酰纈草三酯的總含量不得少于0.80%的要求相差不大[30]。此外,在本研究篩選得到的懸浮培養(yǎng)條件下,歐洲纈草不定根繁殖速度快,為歐洲纈草不定根和有效成分的規(guī)?;a(chǎn)提供了依據(jù)。

    附表1 RCM培養(yǎng)基成分及濃度 Schedule 1 Composition and concentration of RCM

    成分Composition濃度Concentration/(mg·L-1)蔗糖Sucrose30 000KNO380Ca(NO3)2·4H2O288MgSO4·7H2O370NaH2PO412Na2SO499ZnSO4·7H2O2.65H3BO31.5KCl65KI0.75Na2MoO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.02MnCl2·4H2O6Na2EDTA7.4FeCl33.2甘氨酸Glycine3煙酸Nicotinic acid0.5鹽酸吡哆醇Pyridoxine hydrochloride0.1鹽酸硫胺素Thiamine hydrochloride0.1

    [3] 張寧寧, 丁廣治. 蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜類成分及其生物活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 40(10): 1893-1897

    [4] 王茹靜, 黃青, 雍妍, 李鴻翔, 張仕瑾, 陳寶華, 朱利霞, 陳銀, 唐鑫, 宋珊珊, 董小萍, 譚玉柱, 張海. 纈草屬植物的化學(xué)成分及生物活性研究概況[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2016, 41(8): 1405-1414

    [5] 黃和平, 高山林, 王鍵, 黃璐琦, 黃鵬. 何首烏不定根的離體誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng)研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(22): 3857-3860

    [6] 崔磊. 纈草細(xì)胞培養(yǎng)合成纈草素的研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2013

    [7] 李美陽(yáng). 培養(yǎng)條件對(duì)纈草不定根生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(27): 10956-10957, 10959

    [8] 李文杰, 李美陽(yáng), 宮惠. 歐洲纈草不定根誘導(dǎo)與懸浮培養(yǎng)的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2020(1): 179-186

    [9] 侯文慧, 劉勇, 王春國(guó), 劉國(guó)林, 劉倩佟, 昶國(guó)平, 劉潔, 史淑寧, 石晉麗. HPLC法同時(shí)測(cè)定蜘蛛香藥材中纈草三酯類化合物及其降解產(chǎn)物的含量[J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014, 16(12): 2658-2663

    [10] 李琰, 溫鵬飛, 崔蕾, 雷嘉敏, 張興. 微量元素對(duì)雷公藤不定根生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物含量的影響[J]. 林業(yè)科學(xué), 2014, 50(2): 134-138

    [11] 曲偉紅, 趙建國(guó). 瓦松愈傷組織誘導(dǎo)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2010, 21(11): 2832-2833

    [12] 魏振園, 湯若風(fēng), 王晉飛, 董倩倩, 范亞麗, 劉忠華. pH對(duì)槐角愈傷組織黃酮類化合物產(chǎn)量的影響[J]. 廣西植物, 2013, 33(2): 203-207

    [13] 李琰. 雷公藤組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物及其代謝調(diào)控研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2008

    [14] 王思瑤, 崔曈肸, 翟睿, 林香雨, 李欣, 孫璐, 詹亞光, 尹靜. 不同碳源對(duì)檉柳叢生芽生長(zhǎng)、三萜及黃酮物質(zhì)積累的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2017, 53(12): 2189-2196

    [15] 王鵬姬, 高金鋒, 蘇旺, 高小麗, 王鵬科, 馮佰利. 培養(yǎng)條件對(duì)蕎麥愈傷組織生長(zhǎng)及黃酮合成的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2013, 27(5): 591-597

    [16] 尹雙雙. 太子參、杠柳和甘草不定根培養(yǎng)的研究[D]. 天津: 天津大學(xué), 2013

    [17] Lee E J, Mobin M, Hahn E J, Pack K Y. Effects of sucrose, inoculum density, auxins, and aeration volume on ceil growth ofGymnemasylvestre[J]. Journal of Plant Biology, 2006, 49(6): 427-431

    [18] 黃韜, 高文遠(yuǎn), 王娟, 曹宇. 離體培養(yǎng)條件對(duì)人參不定根生長(zhǎng)及其活性成分合成的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(1): 13-17

    [19] Baque M A, Lee E J, Paek K Y. Medium salt strength induced changes in growth, Physiology and secondary metabolite content in adventitious roots ofMorindacitrifolia: The role of antioxidant enzymes and Phenylalanine ammonia lyase[J]. Plant Cell Reports, 2010, 29(7): 685-694

    [20] Zhang J, Gao W Y, Wang J, Li X L. Effects of explant types and media salt strength on growth and secondary metabolite accumulation in adventitious roots ofPeriplocasepiumBunge[J]. Acta Physidogiae Plantarum, 2011, 33(6): 2447-2452

    [21] Kim S H, Kim S K. Effect of sucrose level and nitrogen source on fresh weight and anthocyanin production in cell suspention culture of ‘Sheridan’ grape (Vitisspp)[J]. Journal of Plant Biotechnology, 2002, 4(1):23-27

    [22] 吳春華, 王淼, 宋杭霖, 崔錫花. 無機(jī)鹽和蔗糖濃度對(duì)白色紫錐菊不定根生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物積累影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(9): 1167-1171

    [23] 李慧娟. 東北刺人參不定根反應(yīng)器培養(yǎng)及其抗氧化活性的研究[D]. 延吉: 延邊大學(xué), 2012

    [24] 張悅. 磷缺乏及6-BA對(duì)黃瓜毛狀根生長(zhǎng)及其形態(tài)影響的機(jī)理研究[D]. 廣州: 華南師范大學(xué), 2007

    [25] 王洪秋. 白色紫錐菊不定根培養(yǎng)及抗炎特性的研究[D]. 延吉: 延邊大學(xué), 2018

    [26] 史昆, 楊模華, 李志輝, 張冬林, 王茜,丁貴杰. 馬尾松胚性細(xì)胞懸浮增殖培養(yǎng)體系的建立[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 34(1): 64-68

    [27] 梁朝鋒, 都曉偉, 閆梅. RP-HPLC同時(shí)測(cè)定黑水纈草藥材中纈草烯酸和纈草素含量[J]. 藥物分析雜志, 2011, 31(4): 671-673

    [28] 狄宏曄, 石晉麗, 閆興麗, 趙仁, 劉勇, 肖培根. HPLC法測(cè)定蜘蛛香中纈草素、乙酰纈草素及其分解產(chǎn)物baldrinal[J]. 中草藥, 2007(12): 1892-1894

    [29] 陳玉娟, 石晉麗, 閆興麗, 劉勇, 肖培根. 蜘蛛香中纈草素在不同溶媒中的穩(wěn)定性研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32(5): 349-350

    [30] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典 (2010版, 一部) [M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 345-346

    猜你喜歡
    不定根鹽濃度蔗糖
    煙草不定根發(fā)生研究進(jìn)展
    作物研究(2022年1期)2022-11-27 23:34:38
    HvLBD19基因?qū)Υ篼湶欢ǜl(fā)育的調(diào)控
    不同鹽分條件下硅對(duì)兩個(gè)高羊茅品種生物量分配和營(yíng)養(yǎng)元素氮、磷、鉀吸收利用的影響
    生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及莖表面機(jī)械損傷對(duì)烤煙莖不定根發(fā)生影響
    混合鹽堿脅迫對(duì)醉馬草種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響
    2019年來賓市蔗糖業(yè)總產(chǎn)值近100億元
    硅對(duì)不同抗性高羊茅耐鹽性的影響
    紫錐菊不定根懸浮共培養(yǎng)中咖啡酸衍生物積累研究
    摻HRA 對(duì)蔗糖超緩凝水泥基材料性能的影響
    主鹽濃度對(duì)Au-Pt 合金催化劑性能的影響
    免费在线观看影片大全网站| 国产成人系列免费观看| 宅男免费午夜| 高清毛片免费观看视频网站 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 成人手机av| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美人与性动交α欧美软件| 美女午夜性视频免费| videosex国产| 精品一区二区三区四区五区乱码| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日本黄色视频三级网站网址 | 久久99一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 9191精品国产免费久久| 在线观看人妻少妇| 免费观看人在逋| 亚洲伊人久久精品综合| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩免费av在线播放| 国产一卡二卡三卡精品| 18在线观看网站| 久久久精品94久久精品| 国产视频一区二区在线看| 亚洲国产看品久久| a级毛片在线看网站| 777米奇影视久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品视频人人做人人爽| 中国美女看黄片| 午夜久久久在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产在线一区二区三区精| videosex国产| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久国产电影| 90打野战视频偷拍视频| 日韩大片免费观看网站| 久久久久网色| 人妻 亚洲 视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费看a级黄色片| 免费在线观看完整版高清| 性高湖久久久久久久久免费观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 99精品久久久久人妻精品| 一级片'在线观看视频| 丝袜美足系列| 久久久久久免费高清国产稀缺| 色在线成人网| 国产精品二区激情视频| 黑丝袜美女国产一区| 国产黄频视频在线观看| 高清av免费在线| 午夜福利视频精品| 日韩一区二区三区影片| 嫩草影视91久久| 久久中文看片网| 久久精品亚洲av国产电影网| 黄色毛片三级朝国网站| 丝袜喷水一区| 天天操日日干夜夜撸| 婷婷丁香在线五月| 一边摸一边做爽爽视频免费| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲国产av新网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品一区二区三区av网在线观看 | 日本a在线网址| 日韩大片免费观看网站| 波多野结衣av一区二区av| 久久国产精品大桥未久av| 性少妇av在线| 久久久久网色| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久天堂一区二区三区四区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久国产亚洲av麻豆专区| 91字幕亚洲| 国产免费现黄频在线看| 精品久久久久久电影网| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲,欧美精品.| 国产精品成人在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 天天影视国产精品| 免费观看av网站的网址| 亚洲伊人久久精品综合| 少妇 在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| aaaaa片日本免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 另类亚洲欧美激情| 人人妻人人澡人人看| 精品国产国语对白av| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人三级做爰电影| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美激情高清一区二区三区| www.熟女人妻精品国产| 国产一区二区三区视频了| 亚洲精品美女久久av网站| 人人妻人人澡人人看| 香蕉久久夜色| 久久久欧美国产精品| 一区二区三区精品91| 国产99久久九九免费精品| 日韩免费av在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久影院123| 国产精品久久久久久精品古装| 国产三级黄色录像| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲情色 制服丝袜| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av电影在线进入| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 男男h啪啪无遮挡| 免费黄频网站在线观看国产| 免费人妻精品一区二区三区视频| 香蕉久久夜色| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产单亲对白刺激| 久久国产亚洲av麻豆专区| 激情视频va一区二区三区| 黄色视频不卡| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲 国产 在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 最黄视频免费看| 成人国语在线视频| 丁香欧美五月| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 欧美日韩福利视频一区二区| 日韩有码中文字幕| 亚洲综合色网址| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一区二区三区乱码不卡18| 一本大道久久a久久精品| 国产亚洲av高清不卡| 蜜桃国产av成人99| 亚洲熟妇熟女久久| 狂野欧美激情性xxxx| 麻豆成人av在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品亚洲一级av第二区| 男女之事视频高清在线观看| av国产精品久久久久影院| 少妇精品久久久久久久| 最新的欧美精品一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 操出白浆在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 极品教师在线免费播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产深夜福利视频在线观看| 大香蕉久久成人网| 又黄又粗又硬又大视频| 久久av网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品免费视频内射| 三上悠亚av全集在线观看| 一进一出好大好爽视频| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久国产一级毛片高清牌| 咕卡用的链子| 久久毛片免费看一区二区三区| 99久久国产精品久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 一区二区三区乱码不卡18| 另类亚洲欧美激情| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 久久免费观看电影| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美精品av麻豆av| 免费看a级黄色片| 18在线观看网站| netflix在线观看网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 一二三四社区在线视频社区8| 99热网站在线观看| 亚洲欧美激情在线| 满18在线观看网站| 99久久99久久久精品蜜桃| av欧美777| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲熟妇熟女久久| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜福利欧美成人| 女人精品久久久久毛片| 三上悠亚av全集在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 久久 成人 亚洲| 欧美黑人精品巨大| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人特级黄色片久久久久久久 | 国产成人免费无遮挡视频| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 精品福利观看| 色94色欧美一区二区| www.熟女人妻精品国产| 午夜福利欧美成人| 国产成人欧美在线观看 | 欧美日本中文国产一区发布| 欧美精品av麻豆av| h视频一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲精品国产区一区二| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产三级黄色录像| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜福利一区二区在线看| 国产成人av教育| 亚洲五月色婷婷综合| 黑丝袜美女国产一区| 我的亚洲天堂| 国产不卡av网站在线观看| 成人国产av品久久久| 91国产中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 91精品三级在线观看| 亚洲avbb在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久久国内视频| 水蜜桃什么品种好| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩免费高清中文字幕av| 免费在线观看完整版高清| 老司机福利观看| 亚洲全国av大片| 午夜福利在线观看吧| 一区二区三区乱码不卡18| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美黑人精品巨大| 久久久国产一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 丝袜人妻中文字幕| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产av精品麻豆| 国产成人av激情在线播放| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美成人免费av一区二区三区 | 精品国产一区二区三区四区第35| 成人国产av品久久久| 黄色片一级片一级黄色片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲成人手机| 女性生殖器流出的白浆| 国产99久久九九免费精品| 国产精品国产av在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久视频综合| 日本五十路高清| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久国内视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 99国产精品一区二区蜜桃av | 丝袜喷水一区| 亚洲免费av在线视频| 男人舔女人的私密视频| 日本一区二区免费在线视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 99re在线观看精品视频| 国产97色在线日韩免费| 国产野战对白在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99riav亚洲国产免费| 9热在线视频观看99| 国产亚洲精品久久久久5区| 美女福利国产在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 看免费av毛片| 亚洲熟妇熟女久久| 99精品在免费线老司机午夜| 久久av网站| 国产高清videossex| 久久狼人影院| av网站在线播放免费| 97在线人人人人妻| 99久久精品国产亚洲精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲av第一区精品v没综合| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久人妻av系列| 热99久久久久精品小说推荐| 久久久精品94久久精品| 久久天堂一区二区三区四区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一进一出好大好爽视频| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美在线黄色| 亚洲avbb在线观看| 国产av一区二区精品久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av天堂在线播放| 一进一出抽搐动态| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av福利片在线| 嫩草影视91久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 男人舔女人的私密视频| 精品久久久久久电影网| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲精品乱久久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 老鸭窝网址在线观看| 欧美中文综合在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 曰老女人黄片| www.999成人在线观看| 国产精品av久久久久免费| 久久青草综合色| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产日韩欧美视频二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 成人国产一区最新在线观看| 一级片免费观看大全| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一本综合久久免费| 黄色视频不卡| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 悠悠久久av| 大型av网站在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品乱久久久久久| 精品人妻1区二区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜福利视频在线观看免费| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产在线观看jvid| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 女警被强在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 最新在线观看一区二区三区| 天天影视国产精品| 黑人猛操日本美女一级片| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品国产av在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕av电影在线播放| 国产亚洲欧美在线一区二区| 咕卡用的链子| 欧美在线一区亚洲| 在线观看免费视频日本深夜| 国产欧美日韩一区二区精品| 乱人伦中国视频| 最新在线观看一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费高清在线观看日韩| 不卡av一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 欧美日韩精品网址| 青草久久国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲第一av免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产伦理片在线播放av一区| 脱女人内裤的视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 麻豆av在线久日| 妹子高潮喷水视频| 女警被强在线播放| 丁香欧美五月| 国产精品一区二区在线不卡| 大香蕉久久网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜两性在线视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品欧美一区二区三区在线| 1024香蕉在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品熟女久久久久浪| 国产欧美日韩精品亚洲av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲av电影在线进入| 欧美人与性动交α欧美软件| 视频在线观看一区二区三区| 飞空精品影院首页| 日本vs欧美在线观看视频| 国产又爽黄色视频| 91大片在线观看| 国产精品二区激情视频| 午夜91福利影院| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲天堂av无毛| av天堂在线播放| 久久久国产一区二区| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲av日韩在线播放| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| tocl精华| 免费黄频网站在线观看国产| 国产片内射在线| 在线天堂中文资源库| 国产成人精品久久二区二区免费| 大型av网站在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 99香蕉大伊视频| 男女午夜视频在线观看| 成人18禁在线播放| 国产三级黄色录像| 女性被躁到高潮视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久国产一区二区| 免费在线观看完整版高清| 男男h啪啪无遮挡| 男女免费视频国产| 激情视频va一区二区三区| 一区二区av电影网| 欧美在线黄色| 淫妇啪啪啪对白视频| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产免费现黄频在线看| 欧美日韩精品网址| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美精品av麻豆av| 国产成人精品在线电影| 国产精品1区2区在线观看. | 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久久久精品人妻al黑| 欧美性长视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品人妻1区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 在线天堂中文资源库| av不卡在线播放| 一区二区三区精品91| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人啪精品午夜网站| 一二三四社区在线视频社区8| 一本久久精品| 18在线观看网站| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品久久电影中文字幕 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲欧美激情在线| e午夜精品久久久久久久| 国产欧美日韩一区二区三| 精品高清国产在线一区| 久久免费观看电影| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 男女高潮啪啪啪动态图| 90打野战视频偷拍视频| 久热爱精品视频在线9| 国产国语露脸激情在线看| 国产淫语在线视频| 亚洲色图综合在线观看| 欧美在线一区亚洲| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美日本中文国产一区发布| 在线 av 中文字幕| av福利片在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产福利在线免费观看视频| 午夜视频精品福利| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久水蜜桃国产精品网| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美精品高潮呻吟av久久| 制服人妻中文乱码| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲av美国av| 亚洲专区字幕在线| 成人黄色视频免费在线看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费观看人在逋| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲精品乱久久久久久| 十八禁网站网址无遮挡| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 在线观看免费午夜福利视频| 精品视频人人做人人爽| 午夜福利视频精品| 又大又爽又粗| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美大码av| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人三级做爰电影| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av免费在线观看网站| 精品久久久久久电影网| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲专区字幕在线| 亚洲五月婷婷丁香| 在线观看一区二区三区激情| 国产成人av激情在线播放| 亚洲av日韩在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品 欧美亚洲| 天天添夜夜摸| 999久久久精品免费观看国产| 精品欧美一区二区三区在线| 国产在线免费精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 岛国在线观看网站| 热99re8久久精品国产| 久久久欧美国产精品| 成人永久免费在线观看视频 | 丝袜喷水一区| av国产精品久久久久影院| av超薄肉色丝袜交足视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品影院久久| 精品一区二区三区av网在线观看 | 搡老熟女国产l中国老女人| 香蕉国产在线看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 一级毛片精品| 99riav亚洲国产免费| 国产日韩欧美在线精品| 在线观看免费高清a一片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费看a级黄色片| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产男女内射视频| 一二三四社区在线视频社区8| 黄色视频在线播放观看不卡| 99热网站在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品九九99| 一边摸一边做爽爽视频免费| 91麻豆av在线| 国产成人精品在线电影| 蜜桃国产av成人99| 高清在线国产一区| 欧美激情高清一区二区三区| 18禁观看日本| 久久久久久久久免费视频了| 老鸭窝网址在线观看|