分子診斷技術(shù)在結(jié)直腸癌個體化診療中的作用

帕爾哈提·阿布都熱衣木，穆拉迪力·阿瓦克

（新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院普外科 新疆 烏魯木齊 830002）

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其中直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處結(jié)直腸癌發(fā)病率約為60%，一般從40 歲開始發(fā)病率上升，到60 ～75 歲之間達(dá)到高峰，男性發(fā)病率為女性的兩倍[1]，被公認(rèn)為世界上最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤中死亡原因中排第4 位。新研發(fā)出的分子診斷技術(shù)較長時間以來已經(jīng)在結(jié)直腸癌的早期診斷、分子生物學(xué)上的分型、惡性腫瘤組織的生物學(xué)行為、病情轉(zhuǎn)歸的預(yù)測、藥物的選擇和藥物治療效果的監(jiān)測等方面廣泛應(yīng)用并得到了較成熟的經(jīng)驗，但這種分子診斷技術(shù)對于結(jié)直腸癌個體化診治方面的應(yīng)用相關(guān)的研究仍要求深入探索。

1.結(jié)直腸癌的分子分型

目前相關(guān)研究顯示，結(jié)直腸癌患者中基因型為染色體不穩(wěn)定型（chromosomal instability，CIN）占70%，這是患者染體內(nèi)色體的異常聚集和患者體內(nèi)跟腫瘤有關(guān)的抑癌基因位點雜合性缺失的原因，并存在原癌基因的突變，這種類型的結(jié)直腸癌好發(fā)于遠(yuǎn)端結(jié)腸；約15%結(jié)直腸癌患者因DNA 錯配修復(fù)基因（DNA mismatch repair genes，DNA MMR）缺失而表現(xiàn)為微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（microsatellite instability，MSI），常發(fā)生部位為近端結(jié)腸；另外15%～20%的患者基因型通常與鋸齒狀癌前病變和MSI 通路相互有關(guān)系，常表現(xiàn)為CpG 島表型甲基化（CpG island methylation phenotype，CIMP）型，發(fā)生部位為近端結(jié)腸。1997年在美國第一次推薦根據(jù)MSI 表達(dá)狀態(tài)來將結(jié)直腸癌分為MSI-L型、MSI-H 型和MSS 型；此外，根據(jù)CIMP 不同的狀態(tài)可以把結(jié)直腸癌分為CIMP-H 型、CIMP-L 型和CIMP-0 型。與此同時，在以上分類基礎(chǔ)上可根據(jù)MSI、CIMP 和CIN 狀態(tài)，我們把結(jié)直腸癌分為MSI 型、CIMP-only 型、CIMP+CIN 型、CIN-only 型和三陰型。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種跟結(jié)直腸癌有關(guān)的基因，其中能夠?qū)Y(jié)直腸癌患者的個體化治療起指導(dǎo)作用的基因有KRAS（v-Ki-ras2鼠Kirsten 肉瘤病毒致癌基因同源物）、BRAF（鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1 基因）、PIK3CA（磷酸肌醇-3-激酶催化亞基α 基因）、HER2（人表皮生長因子受體2）[2]和APC（結(jié)腸腺瘤性息肉病基因）[3]。

2.分子標(biāo)志物在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用

2.1 循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）

ctDNA 是指一種存在于血液、腦脊液和滑膜液等細(xì)胞外環(huán)境的脫氧核糖核酸。檢測患者體內(nèi)取得少量樣本中的ctDNA 突變，有助于識別復(fù)發(fā)風(fēng)險高的患者，這既為動態(tài)觀察化療反應(yīng)提供指南，又為少數(shù)結(jié)直腸癌患者制定個體化治療方案提供指南。最近出現(xiàn)的新技術(shù)不僅對ctDNA 中已知突變的監(jiān)測有幫助，還可以通過動態(tài)監(jiān)測結(jié)直腸癌治療過程中發(fā)生的變化來發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌治療中出現(xiàn)的新耐藥機制；研究發(fā)現(xiàn)罹患結(jié)腸腫瘤的人體中ctDNA 的含量顯著高于未患有結(jié)直腸癌的健康人體中血液循環(huán)腫瘤基因，這提示可以把血清中ctDNA 含量檢測出來，并把檢測結(jié)果當(dāng)做發(fā)現(xiàn)早期結(jié)直腸癌患者的篩選指標(biāo)。

2.2 循環(huán)游離細(xì)胞DNA（Circulating cell-free DNA，cfDNA）

cfDNA 是循環(huán)血中游離于細(xì)胞外的部分降解而產(chǎn)生的機體內(nèi)源性脫氧核糖核酸；在惡性腫瘤患者的體內(nèi)，ctDNA 是來自cfDNA 一部分的分子標(biāo)記物，而在外周血中壞死或程序性死亡（凋亡）的非腫瘤細(xì)胞也在外周血中釋放cfDNA。研究結(jié)果顯示，腫瘤患者體內(nèi)外周血ctDNA 含量高，并且腫瘤患者體內(nèi)ctDNA 跟腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織的生物學(xué)特點相同，這表明腫瘤患者體內(nèi)的大多數(shù)cfDNA 由腫瘤細(xì)胞釋放而來[4]。Frattini 等[5]動態(tài)監(jiān)測結(jié)腸腫瘤患者的cfDNA 的含量顯示已經(jīng)接受手術(shù)治療的結(jié)腸腫瘤患者體內(nèi)的cfDNA 含量大幅度下降，而病情惡化的患者體內(nèi)的cfDNA 含量是非常高的，可用cfDNA 來進(jìn)行動態(tài)觀察人體內(nèi)腫瘤的遺傳信息的表達(dá)和變化、估計病情轉(zhuǎn)歸，評定對結(jié)腸腫瘤的生長抑制或打擊效果。

2.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTC）

CTC 是腫瘤患者的外周血中存在的具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞。結(jié)直腸癌的診斷過程常涉及到與CTC 相關(guān)的一些標(biāo)記物，目前最常并具有特征的標(biāo)記物有EpCAM、CKl8、19、20 及CEA[6]；目前，檢查出的CTC 在臨床實踐中的應(yīng)用主要包括對可疑患者進(jìn)行診斷、結(jié)直腸腫瘤患者病情控制情況的評估兩個方面。

2.4 微小RNA（microRNA，miRNA）

是一類非編碼單鏈RNA 分子，作為一種跟遺傳相關(guān)的重要分子，經(jīng)常參加基因表達(dá)的調(diào)控，從而成為一種跟致病密切相關(guān)的遺傳物質(zhì)。miRNA 能阻斷遺傳信息的翻譯或加速目標(biāo)mRNA 的降解，從而精細(xì)地調(diào)節(jié)生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和腫瘤的出現(xiàn)等生物學(xué)過程[7]。李雪等[8]從結(jié)直腸腫瘤組織中提取miRNA452-5P，發(fā)現(xiàn)這種非編碼的單鏈RNA 分子基因表達(dá)水平明顯降低，而miRNA215-5p 基因表達(dá)水平明顯上升，且2-miRNAs panel 對結(jié)直腸癌有較高的診斷價值，能夠當(dāng)做結(jié)直腸癌診斷價值的潛在的分子標(biāo)志物和治療靶點。王勝等[9]發(fā)現(xiàn) miR-1183 的基因表達(dá)水平在結(jié)直腸腫瘤組織中最高。結(jié)直腸癌患者血清中miR-200a 和miR-190 的表達(dá)水平均下降，可當(dāng)作早期診斷結(jié)直腸癌和預(yù)測手術(shù)治療后復(fù)發(fā)的標(biāo)志物，兩者聯(lián)合檢測時效果更佳。

3.結(jié)直腸癌相關(guān)信號通路和靶向藥物的作用

3.1 表皮生長因子受體（EGFR）通路

EGFR 是跨膜受體，十種不同的配體可以選擇性地結(jié)合每個受體，配體與單鏈EGFR 結(jié)合后，受體形成二聚體，通過酪氨酸激酶活性激活受體自磷酸化，從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)出信號，而自磷酸化觸發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)途徑，可能導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、阻斷凋亡、活化、向周圍侵犯和轉(zhuǎn)移，并刺激新的腫瘤血管形成。結(jié)直腸癌患者攜帶的原癌基因KRAS的突變能直接激活下游的MAPK信號通道，從而引起抗EGFR 單克隆抗體無效，甚至?xí)霈F(xiàn)攜帶KRAS 基因突變的患者因使用抗EGFR 單克隆抗體（EGFRmAb）治療而受傷害。

3.2 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路

PI3K/AKT 信號通路通過介導(dǎo)EGFR 進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，外顯子9 和外顯子20 均發(fā)生突變的結(jié)直腸癌患者約為15%，外顯子20 突變的同時外顯子9 表現(xiàn)為野生型的結(jié)直腸癌患者與抗EGFR 單克隆抗體耐藥相關(guān)。結(jié)直腸癌患者體內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α 基因（PIK3CA）的突變導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3）的激活，進(jìn)一步增加環(huán)氧化酶2（COX2）的活性和促進(jìn)前列腺素E2（PGE2）的合成而阻礙結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。

3.3 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）

VEGF 是一種作用很強的血管生成刺激因子，即能加快腫瘤血管生成又能使血管通透性增強，與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。貝伐單抗作用于VEGF 通路，能顯著的抑制腫瘤血管生成，進(jìn)一步阻止腫瘤細(xì)胞經(jīng)血液轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的組織器官上形成轉(zhuǎn)移瘤，抑制腫瘤細(xì)胞向周圍侵襲，因此，貝伐單抗目前臨床上作為一線靶向藥物。

4.展望

目前，隨著治療模式的逐漸成熟，能有效治療多數(shù)結(jié)直腸癌患者，但對每一位結(jié)直腸癌患者，降低治療成本而得到最優(yōu)化的治療效果、最大限度降低藥物不良反應(yīng)、對腫瘤轉(zhuǎn)歸良好的判斷，需要對每一位結(jié)直腸癌患者個體進(jìn)行具體分析。為達(dá)到延長患者壽命、提高生存質(zhì)量的目的，檢測分子標(biāo)記物來分析化療藥物在腫瘤細(xì)胞中代謝機制是重要的一步，但是依靠目前的醫(yī)學(xué)檢測條件仍無法找到結(jié)直腸癌分子生物學(xué)分型的標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有分型方法仍不完整，存在許多缺陷，僅根據(jù)腫瘤細(xì)胞中少數(shù)的遺傳物質(zhì)的檢測還不能對結(jié)直腸癌患者完整的實施個體化治療方案，多因素綜合分析會成為未來個體化治療的發(fā)展方向。