新型藥物載體外泌體的研究現(xiàn)狀與展望

何夢鋮，胡春梅，張治元，丁一楠，唐秋莎

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，江蘇 南京 210009)

Pan等[1- 2]于1983年首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體，在1987年他們將這些功能性囊泡定義為外泌體(exosome)。外泌體，一種細(xì)胞外囊泡亞型，是細(xì)胞衍生的生物聚合物，直徑30～120 nm，密度在1.13～1.19 kg·L-1之間，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及生化和機(jī)械性能[3]。現(xiàn)已知幾乎所有培養(yǎng)的細(xì)胞都能夠分泌出外泌體，它還存在人體的體液中, 包括尿液[4]、唾液[5]、血液[6]、腦脊液[7]、乳汁[8]等。這些囊泡包含的生物分子如mRNA、miRNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，能夠支持外泌體協(xié)助細(xì)胞間溝通。近年來由于外泌體獨(dú)特的生物特性，相關(guān)的研究逐步增多，外泌體被廣泛應(yīng)用于臨床的診斷和治療中。此外，作為內(nèi)源性的納米材料，外泌體在人體內(nèi)遞送藥物方面也已被證實(shí)具有巨大優(yōu)勢。本文作者就近年有關(guān)外泌體作為藥物載體的研究進(jìn)展作回顧與總結(jié)，并討論外泌體的研究前景。

1 外泌體的形成與生物特性

外泌體來源于早期細(xì)胞的內(nèi)吞作用產(chǎn)生的小囊泡，小囊泡在細(xì)胞內(nèi)形成核內(nèi)體，在高爾基體的幫助下，晚期核內(nèi)體中積聚大量“貨物”，生成大量的腔內(nèi)小泡(intralumenal vesicles, ILVs)，形成多泡體(multivesicular body, MVB)。這種轉(zhuǎn)化伴隨著一個(gè)貨物分類過程，將可溶性分子組分招募到腔內(nèi)小泡中，例如細(xì)胞質(zhì)蛋白和脂質(zhì)[9]。不同的MVBs有著不同的命運(yùn)，它們可能與溶酶體融合，導(dǎo)致內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物的降解；或與母細(xì)胞的質(zhì)膜融合，導(dǎo)致內(nèi)囊泡以胞外方式釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，即外泌體[10]。

外泌體內(nèi)包含有大量不同種類的蛋白質(zhì)、 mRNA等生物活性物質(zhì)。由于外泌體是由內(nèi)吞途徑產(chǎn)生的，它們包含Tsg101分子等內(nèi)泌體成分。外泌體包含的蛋白有細(xì)胞骨架成分(微管蛋白、肌動(dòng)蛋白和膜聯(lián)蛋白)、多泡體生成相關(guān)的蛋白(Alix、TSG101)、四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸分子(Rab-GTP酶家族和SNARE)、膜分子[整合素、黏附分子1(ICAM-1)]、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)以及與外泌體來源相關(guān)的細(xì)胞特異性蛋白[11- 13]，其中CD9和CD63常被當(dāng)作外泌體的分子標(biāo)志[14]。此外，已有研究報(bào)道常見的脂類如磷脂酰乙醇胺、二?；视?、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸、雙磷酸腺苷酸、膽固醇和鞘磷脂存在于外泌體中[15]。而外泌體表面豐富的蛋白使其可以與靶細(xì)胞膜上的特異性蛋白結(jié)合，使其具有靶向性[16]。

外泌體有3種可能影響受體細(xì)胞的方法。(1) 內(nèi)吞：內(nèi)吞途徑是導(dǎo)入外泌體的傳統(tǒng)方式，有助于影響受體細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)途徑；(2) 受體-配體相互作用：通過這種方式外泌體表面分子與位于靶細(xì)胞質(zhì)膜(plasma membrane, PM)上的分子相互作用；(3) 直接融合：直接與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合釋放 mRNA、miRNA 從而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[17]。外泌體通過上述方式與相鄰細(xì)胞或遠(yuǎn)處細(xì)胞相互作用,將其所包含的內(nèi)容物在不同細(xì)胞間傳遞，在細(xì)胞行為以及細(xì)胞通訊中起到了重要作用。

目前在人體各個(gè)系統(tǒng)中都發(fā)現(xiàn)了外泌體的存在，證實(shí)外泌體在疾病的診療方面具有重要作用:(1) 外泌體在腫瘤疾病診斷方面的作用。盡管許多細(xì)胞都能釋放外泌體，但是有數(shù)據(jù)表明腫瘤細(xì)胞外泌體分泌量更加突出[18]，所以外泌體在腫瘤診斷方面表現(xiàn)出了高度的特異性。例如胰腺癌患者血清外泌體中miRNA-17-5p和miRNA-21的含量相較于正常人明顯升高[19]。(2) 外泌體在心血管系統(tǒng)疾病診斷方面的作用。Ribeiro-rodrigues等[20]發(fā)現(xiàn)缺血心肌細(xì)胞的外泌體含有大量促血管生成的miR-143和miR-222。含有miR-143和miR-222的外泌體能夠通過刺激毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成增強(qiáng)屏障特性以及刺激新血管生成而促進(jìn)心臟血管生成。(3) 外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)診斷方面的作用。由于外泌體可以通過血腦屏障，外泌體在人體神經(jīng)系統(tǒng)中也有重要意義。腦內(nèi)神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞等均可分泌外泌體。Goetzl等[21]比較了阿爾茨海默病患者與正常人血漿神經(jīng)源性外泌體成分，發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-6、熱休克因子-1和阻遏因子1-沉默轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平均顯著低于正常人。

2 外泌體作為藥物載體的優(yōu)勢

目前在臨床和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用藥物載體主要為病毒載體和非病毒載體，但是它們本身都具有不可忽視的局限性。病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等，它們的特異性較低、安全性較弱、靶向性不足以及潛在致癌性都是限制病毒載體臨床應(yīng)用中的重要問題[22]。而對于非病毒載體，藥物包載效率低、缺乏靶向性的問題同樣不可忽視[23]。

在新型的藥物載體中，外泌體受到青睞。已知外泌體與傳統(tǒng)藥物載體相比，有以下優(yōu)勢：(1) 來源廣泛。幾乎所有培養(yǎng)的細(xì)胞都能分泌外泌體，它還廣泛存在于人體體液中。(2) 良好的生物相容性和非免疫原性。自源性的外泌體經(jīng)修飾后作為藥物載體，降低了發(fā)生免疫反應(yīng)的概率，在體內(nèi)不易被清除，保證了足夠的循環(huán)時(shí)間，從而提高了利用效率[24]。(3) 納米尺度。納米級分子的外泌體能夠逃脫單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的快速清除[25]，可以利用增強(qiáng)滲透滯留(enhanced permeability and retention effect, EPR)效應(yīng)滲入到腫瘤內(nèi)發(fā)揮作用[26]，還能因此通過包括血腦屏障在內(nèi)的絕大多數(shù)生物屏障系統(tǒng)。(4) 穩(wěn)定性高。外泌體能夠保護(hù)包載的藥物在人體復(fù)雜的環(huán)境中不被降解，隨后通過膜融合將藥物直接運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中。(5) 一定的的靶向性。由于外泌體是由細(xì)胞產(chǎn)生的，具有跨膜蛋白和表面受體等特異性蛋白，可避免或促進(jìn)特定(目標(biāo))細(xì)胞的識(shí)別和相互作用[27]。(6) 外泌體膜修飾方式多樣。(7) 外泌體作為載體可以使藥物攝取量更大、循環(huán)時(shí)間更久、藥物釋放更加持續(xù)[28]。(8) 應(yīng)用沒有異倍體風(fēng)險(xiǎn)[29]。

3 外泌體的提取與純化

作為藥物載體，高純度和數(shù)量是外泌體廣泛應(yīng)用的首要條件，所以外泌體的提取純化方法一直都是研究的熱點(diǎn)之一。不同方法提取出來的外泌體的純度、活性、產(chǎn)量均不相同，選擇合適的提取方法是外泌體應(yīng)用的前提條件。

3.1 差速超速離心法

差速超速離心法是目前最經(jīng)典、也是應(yīng)用最廣泛的提取方法。通過逐漸增大離心力逐步去除血清中的死亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片，得到的肉眼可見淡黃色沉積物即為外泌體，用PBS重懸后保存。 但是這種方法比較繁瑣、耗時(shí)，高速度離心可能導(dǎo)致顆粒與污染物和其他蛋白質(zhì)融合，影響外泌體的物理特性和蛋白質(zhì)組學(xué)分析的敏感性[30]。巨大的離心力有可能引起樣品中外泌體丟失，導(dǎo)致外泌體產(chǎn)量減少。

3.2 超濾離心法

超濾離心法使用具有預(yù)定孔徑和孔密度的超濾膜對上清進(jìn)行分離提取外泌體。相比差速超速離心法，超濾離心法不僅省時(shí)省力，而且回收率和純度更高，對于在無細(xì)胞樣品(如尿液、血清和細(xì)胞培養(yǎng)基)中分離外泌體尤為有效[31]。但是這種方法得到的外泌體純度低，而且離心過程中部分外泌體會(huì)黏附在濾膜上，影響外泌體的產(chǎn)量[32]。

3.3 蔗糖墊超速離心法

因?yàn)檎崽堑拿芏?1.12～1.18 g·ml-1)與外泌體的密度(1.13～1.19 g·ml-1)相當(dāng)，所以可產(chǎn)生緩沖作用。首先通過300×g和10 000×g的超速離心預(yù)處理，去除上清中的細(xì)胞碎片和壞死細(xì)胞。隨后加載到30%蔗糖溶液中，100 000×g超速離心，去除高密度(1.22 g·ml-1)的蛋白質(zhì)污染物，這種方法得到的外泌體完整性更好，純度更高[33]。但是同樣存在與外泌體密度相等的雜質(zhì)無法去除的問題。

3.4 尺寸排阻色譜法(SEC)

SEC是基于大小的分離技術(shù)。確定好膠體固定相孔徑的大小，混合物中流體動(dòng)力學(xué)半徑較小的顆粒能夠通過孔，而半徑大于孔的顆粒則無法進(jìn)入孔中。SEC分離血漿中外泌體可達(dá)到較高的純度，但是生產(chǎn)效率仍有待商榷[31]。

3.5 聚合物沉淀法

聚合物沉淀法是通過加入沉淀試劑來改變外泌體的溶解度，使外泌體能夠通過膜或者低速離心的方式得到外泌體的沉淀物。相比其他方法，聚合物沉淀法不需要專門的設(shè)備，簡便易操作，但是會(huì)產(chǎn)生更多的非外泌體雜質(zhì)，比如雜質(zhì)蛋白質(zhì)和聚合材料[34]。

3.6 微流控技術(shù)

微流控技術(shù)是通過特有的微流控芯片，結(jié)合粒徑、生物膜電荷分布特點(diǎn)、黏彈性等其它物理特性，來達(dá)到分離外泌體的目的。其它提取方法需將分離與鑒定過程分隔開，既耗時(shí)又增加了外泌體污染的機(jī)會(huì)，而微流控技術(shù)靈敏度高，可直接在體液中對外泌體進(jìn)行檢測和定性，適用于所有體液中的外泌體[31]。但該領(lǐng)域仍處于起步階段，對技術(shù)要求高，更適用于微量樣品，相比較應(yīng)用于分離與提純，微流控技術(shù)用于檢測無疑是更好的選擇。

4 外泌體作為藥物載體的應(yīng)用

4.1 基因類藥物

基因類藥物主要分為miRNA、siRNA、mRNA，由于RNA干擾(RNA interference)的特異性基因抑制具有巨大的治療應(yīng)用潛力，近年來研究人員通過多種方法來達(dá)到miRNA和siRNA在體內(nèi)的高效靶向傳遞的效果。研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與神經(jīng)修復(fù)過程，而腦卒中患者的神經(jīng)修復(fù)能力弱，將狂犬病病毒糖蛋白(RVG)融合到溶酶體相關(guān)膜糖蛋白2b修飾的外泌體中，可以將miR-124遞送到腦卒中后的梗死部位，以促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[35]。利用口腔癌患者頰部組織中miR-185顯著降低的特點(diǎn)，Wang等[36]利用間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體運(yùn)輸miR-185，粘貼于致癌劑二甲基苯蒽誘導(dǎo)的口腔潛在惡性疾病模型的頰部病變上，口腔惡性疾病的發(fā)生率顯著降低，免疫組化也顯示處理的病變中增殖標(biāo)志物PCNA和血管生成標(biāo)志物CD31表達(dá)明顯下降，證明了其抗炎抗新生血管功能。葉酸(folic acid, FA)受體是一種在癌細(xì)胞上高表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白，在癌癥選擇性治療上具有優(yōu)越性，但FA-siRNA療法具有內(nèi)核體逃逸困難的問題。Zheng等[37]通過熒光顯微鏡技術(shù)證實(shí)，與沒有外泌體的FA-siRNA相比，包繞于外泌體的FA-siRNA通過外泌體受體介導(dǎo)的胞質(zhì)傳遞能力避免了核內(nèi)體的捕獲，達(dá)到siRNA的干擾效果，證實(shí)了外泌體裝載siRNA在腫瘤治療中的潛力。

4.2 小分子藥物

4.2.1 紫杉醇(paclitaxel, PTX) PTX 是一種天然的抗腫瘤藥物，但是其毒性以及疏水性限制了其應(yīng)用，所以對于載體的選擇極為重要。將骨髓來源的SR8947與PTX共同孵育，培養(yǎng)出包載PTX的外泌體。將加載有PTX的外泌體和CFPAC-1細(xì)胞共同注入小鼠體內(nèi)，癌細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制。此外骨髓來源的MSCs并不是唯一保留攝取或釋放PTX特性的基質(zhì)細(xì)胞，即使從脂肪組織或真皮中分離出的其他基質(zhì)細(xì)胞也具有這種特性[38]。

4.2.2 姜黃素 姜黃素是一種存在于姜黃根莖中的天然多元酚，具有抗炎、抗惡性腫瘤、抗氧化等廣泛作用，但其腸肝代謝不明顯、穩(wěn)定性差、全局性清除快、水溶性差的特征限制了它的應(yīng)用[39]。Aqil等[40]在裸鼠體內(nèi)種植了人宮頸癌細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖為對照，分別單用外泌體、姜黃素或載有姜黃素的外泌體喂食，結(jié)果顯示，僅裝載有姜黃素的外泌體喂食的大鼠腫瘤受到明顯抑制。這證明了外泌體在作為姜黃素載體方面具有極其明顯的優(yōu)勢，克服了姜黃素清除快、代謝不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。

4.3 蛋白類藥物

蛋白質(zhì)藥物具有分子質(zhì)量大、不能口服等缺點(diǎn)，而外泌體由于良好的生物相容性和穩(wěn)定性成為優(yōu)先考慮的載體。Haney等[41]在體外將高效抗氧化劑過氧化氫酶包載到外泌體中，經(jīng)鼻內(nèi)給藥后在帕金森小鼠的大腦中檢測到大量外泌體，證實(shí)了含有過氧化氫酶的外泌體可以將大量酶傳遞到目標(biāo)神經(jīng)元，提供抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)活性。

5 不足與展望

盡管外泌體在臨床應(yīng)用上有非常好的前景，但在研究初期仍然存在一些問題:(1) 產(chǎn)率低下，分離提純難。目前最常用的分離方式是差速超速離心法，該方法提取外泌體的純度高但操作復(fù)雜、耗時(shí)長且成本昂貴，解決方案包括優(yōu)化現(xiàn)有的提取方法、將多種提取方法相結(jié)合用于分離與提純。有研究人員依據(jù)外泌體優(yōu)異的生物學(xué)特性，提出了外泌體-模擬納米囊泡(exosome-mimetics)的設(shè)想，這樣的藥物傳遞系統(tǒng)具有外泌體的優(yōu)點(diǎn)，而且生產(chǎn)過程更容易[42]。(2) 靶向性不足。外泌體具有一定的靶向性，但是在復(fù)雜的人體環(huán)境中，外泌體本身的靶向性不足以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)的靶向給藥需求，需要通過化學(xué)修飾使外泌體表面表達(dá)特定的靶向分子。但是，修飾后的外泌體是否會(huì)引起機(jī)體免疫反應(yīng)、是否保持原有功能尚不確定。后續(xù)研究中成熟完善的靶向修飾技術(shù)是實(shí)現(xiàn)外泌體廣泛臨床應(yīng)用的重要前提。(3) 載藥方式不完善。目前最常用的外泌體載藥方式是轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。轉(zhuǎn)染法是通過轉(zhuǎn)染劑或讓藥物與外泌體共同孵育將藥物轉(zhuǎn)進(jìn)外泌體，但殘留的轉(zhuǎn)染試劑可能會(huì)影響封裝過程和改變外泌體的細(xì)胞功能[43]。電穿孔法則是在外泌體外增加一個(gè)外界電場，能量達(dá)到一定程度會(huì)在外泌體表面電擊出可修復(fù)的小孔，增加外泌體膜通透性，允許藥物、DNA、RNA等小分子物質(zhì)進(jìn)入外泌體[44]。但電穿孔法容易引起外泌體聚集，對藥物和外泌體的完整性會(huì)產(chǎn)生影響[45]，對此我們可以考慮在電穿孔過程中加入一定的膜保護(hù)劑，減輕外泌體的聚集。

近年來，關(guān)于外泌體的研究報(bào)道不斷增多，大多數(shù)是將外泌體用作藥物載體。在癌癥化療藥物靶向性方面，外泌體因其免疫原性小、靶向潛力大，有望成為重要的化療藥物載體。目前存在常用外泌體提取方法產(chǎn)量低、外泌體自身靶向性弱、載藥效率較低等問題。通過外泌體模擬囊泡可能有助于提高外泌體產(chǎn)量，未來研究的重點(diǎn)除了要完善外泌體制備方法，還應(yīng)將目前限于實(shí)驗(yàn)室的外泌體研究實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化加以推廣應(yīng)用。隨著研究進(jìn)展，外泌體作為藥物載體一定會(huì)促進(jìn)臨床疾病的診斷與治療。