基于丁香苦苷抗菌藥效研究的丁香葉質(zhì)量標(biāo)志物指認(rèn)

張喜武，楊斯棋，李永吉，劉振強(qiáng)，朱健，張麗麗，竇金金

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

丁香葉為木犀草科植物[1]，味苦、性寒為東北地區(qū)特色藥材[2]，有清熱燥濕、解毒、消炎、利濕退黃之功效[3]。藥用價(jià)值早在民間就已被認(rèn)知是一味極具開發(fā)潛力的中藥，常用于治療腹瀉、爆發(fā)性火眼膜炎以及黃疸型肝炎等疾病[4]，體內(nèi)外都具有較好的抗菌作用[5]。以丁香葉為原料的炎立消膠囊以及片劑等劑型具有很好的抗菌、抗病毒、抗炎作用[6-7]，也有較多文獻(xiàn)報(bào)道，但究竟是何種成分發(fā)揮著抗菌、抗病毒、抗炎作用目前尚不明確，雖有少數(shù)綜述報(bào)道丁香苦苷有可能成為其有效成分，但又都缺乏其抗菌的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，本課題組在明確了丁香苦苷具有抗乙肝病毒作用[8]的研究基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了抗菌的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)而深入挖掘丁香苦苷的藥效作用，明確丁香苦苷在丁香葉成分中的藥效學(xué)位置，為丁香苦苷成為丁香葉的質(zhì)量標(biāo)志物奠定研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品

丁香葉2017年9月采于哈爾濱，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為木犀科Oleaceae丁香屬Syringa植物紫丁香SyringaoblataLindl.的干燥葉，樣品保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(20170918)。丁香苦苷原料實(shí)驗(yàn)室自制；丁香苦苷對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)面積歸一化法測(cè)定純度大于98%)；炎立消膠囊(哈爾濱華瑞生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20180504)；炎可寧片(吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20180307)；頭孢克肟膠囊(哈爾濱三精海靈藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20180413)；黃連素片(安徽國(guó)森藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20180520)；雙黃連口服液(哈爾濱中藥二廠，批號(hào)：20180619)。

丁香苦苷的制備：取丁香葉10 kg，加8倍量水煎煮2次，合并水煎液，濃縮，上HPD 500大孔吸附樹脂柱，分別用水、30%(v/v)乙醇、50%(v/v)乙醇洗脫，收集50%(v/v)乙醇洗脫部分。50%(v/v)乙醇洗脫液，減壓回收乙醇后，水定容至一定體積，乙酸乙酯萃取3次，回收溶劑，冷凍干燥，得丁香葉提取物[9]。丁香葉提取物經(jīng)硅膠柱色譜(CHCl3-MeOH梯度洗脫)分離，分別得到A、B、C、D四組分。組分C再用硅膠柱色譜(CHCl3-MeOH梯度洗脫)分離，獲得丁香苦苷原料。

1.2 主要試劑

10%水合氯醛(北京化工二廠，批號(hào)：20180521)，分析純10%福爾馬林(北京化工二廠，批號(hào)：20180518)，MH肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180811)營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180812)。

1.3 菌株

ATCC25923金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、ATCC25922大腸桿菌(Escherichiacoli)、ATCC27853銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、購(gòu)于黑龍江省農(nóng)科院；ATCC51210福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、ATCC51203宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei)、ATCC51054痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、ATCC26104白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、ATCC49103變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)、ATCC46114肺炎桿菌(Pneumobacillus)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 主要儀器

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，DHC-1300ⅡA/B型生物潔凈柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司),ZDX-35B型電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 定性鑒別

取適量丁香苦苷對(duì)照品，加甲醇溶解，制成0.02 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取丁香苦苷原料藥(20180501)適量，加甲醇溶解，制成0.1 mg·mL-1的溶液，作為供試品溶液。按照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄ⅤD)試驗(yàn)文獻(xiàn)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫30 ℃；以甲醇-水(50∶50)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為221 nm ；流速為1 mL·min-1。取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄主峰的保留時(shí)間。

2.2 倍比稀釋法

采用二倍稀釋法，用微量加樣器將MH肉湯培養(yǎng)基100 μL加到96孔板第2～8孔中，第1孔不加。取滅菌藥液100 μL加到第1孔及第2孔中，從第2孔開始將藥液和MH肉湯充分混勻后吸取100 μL加到第3孔中充分混勻后再吸取100 μL加到第4孔中，如此反復(fù)，依次稀釋至第8孔，混勻后吸取100 μL棄去。每孔分別加入106CFU/mL的菌液100 μL。同時(shí)設(shè)有不加菌的樣品對(duì)照孔和不加樣品的菌液生長(zhǎng)對(duì)照孔。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，按照上述操作流程重復(fù)做3次平行實(shí)驗(yàn)。

2.3 打孔法

將未稀釋前的菌液(即含菌量為5×107～5×108CFU/mL)用棉簽均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)皿上，然后用滅菌的6 mm打孔器在MH瓊脂上均勻地打6個(gè)孔，每孔注入50 μL的供試藥物，(各藥物濃度為：丁香苦苷原料200 mg·mL-1，炎立消膠囊200 mg·mL-1，炎可寧片200 mg·mL-1，頭孢克肟膠囊128 μg·mL-1，黃連素片100 mg·mL-1，雙黃連口服液用原液。37 ℃培養(yǎng)，18 h取出，測(cè)定抑菌環(huán)直徑，按照上述操作流程重復(fù)做3次平行實(shí)驗(yàn)，抑菌環(huán)直徑取其平均值。

2.4 體外殺菌實(shí)驗(yàn)

采用二倍稀釋法，用微量加樣器將MH肉湯培養(yǎng)基100 μL加到96孔板第2～8孔中，第1孔不加。取滅菌丁香苦苷藥液100 μL加到第1孔及第2孔中，從第2孔開始將藥液和MH肉湯充分混勻后吸取100 μL加到第3孔中充分混勻后再吸取100 μL加到第4孔中，依次稀釋至第8孔，混勻后吸取100 μL棄去。每孔加入106CFU/mL的菌液100 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照上述方法再進(jìn)行炎立消膠囊、炎可寧片、頭孢克肟膠囊、黃連素片、雙黃連口服液對(duì)照藥物96孔板實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。以細(xì)菌不生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該細(xì)菌的MIC值為最終結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 定性鑒別結(jié)果

供試品峰保留時(shí)間與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致。定性鑒別結(jié)果見圖1。

圖1 丁香苦苷對(duì)照品和自制丁香苦苷原料藥的色譜圖

由圖1結(jié)果顯示，制備得到的丁香苦苷原料藥在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間上，呈現(xiàn)相同色譜峰，表明該原料藥為丁香苦苷。

丁香苦苷為淡黃色粉末，味極苦，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。分子式C24H30O11，分子量494.5，熔點(diǎn)156～156.5 ℃?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖2、圖3。

圖2 丁香苦苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖3 丁香苦苷的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)

UV光譜：λmax nm(ε)221(11 500) ，271(470)。

IR光譜：VKBrmax 1 734，1 692，1 633，1 516，843。

1H-NMR譜：(500 MHz，CD3OD)δ7.00 (2H，d， J=8.5 Hz， H-2″，H-6″) ， 6.68(2H，dd， J=8.5，2 Hz，H-3″，H5″)，2.80(2H，t，J=6.5 Hz，H-α)，4.21(2H，t，J=6.5 Hz,H-β)， 5.57 (1H， d， J=3 Hz，H-1)， 7.40(1H，d，J=6.5 Hz，H-3)， 2.86 (1H，dd， J=12， 2 Hz，H-5)， 2.51(1H， dd，J=19.2，8 Hz，H-6α)，2.37(1H，dd， J=19.2，8 Hz，H-6β)， 2.06(1H， dq，H-8)， 2.28(1H， ddd， J=14，7.2，3.5，H-9)， 4.64(1H，d，J=8 Hz，H-1)， 3.62 (1H，dd，J=14，6.5 Hz，H-6α)， 3.56(1H，dd，J=14，6.5 Hz，H-6′β)。

13C-NMR譜:(500 MHz，CD3OD)δ95.41(C-CH)，153.19(C-3，-CH)， 111.18(C-4，-C)， 28.22(C-5，-CH)， 43.5(C-6，43.5)， 220.74(C-7，-C)， 46.62(C-8，-CH)， 44.46(C-9，-CH)， 13.67(C-10，-CH3) 168.37(C-11，-C)， 100.19(C-1′，-CH)， 74.62(C-2′，-CH)， 77.93 (C-3′，-CH)， 71.53(C-4′，-CH)， 78.36 (C-5′，-CH)， 62.71(C-6′，-CH2)，130.09(C-1″，-C)，130.90(C-2″，C-6″，-CH)， 116.29(C-3″，C-5″，-C)， 157.02(C-4″，-C)， 66.29(C-α，-CH2)，35.26(C-β，-CH2)。

3.2 倍比稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1結(jié)果顯示，丁香苦苷對(duì)選定的9個(gè)菌株均有抑菌作用，以細(xì)菌不生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該細(xì)菌的MIC值為最終結(jié)果[10]。其中對(duì)白色葡萄球菌及肺炎桿菌抑菌作用較強(qiáng)，MIC為3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1；對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、變形桿菌等5個(gè)菌株MIC為12.5 mg·mL-1；對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌抑制作用一般，MIC為50 mg·mL-1。

表1 丁香苦苷的抑菌效果和最低抑菌濃度

3.3 打孔法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從打孔法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2可以看出，丁香苦苷與對(duì)照藥炎立消膠囊和炎可寧片比較可知，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用強(qiáng)于炎可寧片，稍差于炎立消膠囊，對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌丁香苦苷、炎立消膠囊和炎可寧片均無(wú)抑菌環(huán)，表明對(duì)大腸桿菌抑菌、銅綠假單胞桿菌作用不明顯。對(duì)白色葡萄球菌、肺炎桿菌、痢疾志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、變形桿菌與炎立消膠囊和炎可寧片的抑菌作用基本相當(dāng)。對(duì)福氏志賀氏菌的抑菌作用比炎立消膠囊和炎可寧片的均強(qiáng)。與雙黃連口服液相比較，抑菌作用均不及雙黃連口服液明顯。與黃連素片對(duì)比，黃連素片對(duì)銅綠假單胞桿菌有抑菌環(huán)，強(qiáng)于丁香苦苷，其余均不及丁香苦苷。

表2 不同供試藥物對(duì)九種菌株的抑菌環(huán)直徑(mm)

注:/表示在選定的藥物濃度下沒有抑菌環(huán)。

丁香苦苷對(duì)選定的9個(gè)菌種中的7個(gè)菌種有抑菌作用。對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌沒有抑菌環(huán)；比較倍比稀釋法結(jié)果，說(shuō)明丁香苦苷對(duì)這兩個(gè)菌種的抑菌作用不明顯，對(duì)其余7個(gè)菌種有抑菌作用。

3.4 體外殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知丁香苦苷對(duì)大部分菌株均有殺菌作用，其中對(duì)白色葡萄球菌和肺炎桿菌作用顯著，MBC分別3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1；對(duì)痢疾志賀氏菌福氏志賀氏菌變形桿菌金黃色葡萄球菌殺菌效果相近；對(duì)宋內(nèi)氏志賀氏菌殺菌作用一般，MBC50 mg·mL-1；在最大藥物濃度下對(duì)大腸桿菌，銅綠假單胞桿菌沒有殺菌作用。

表3 不同供試藥物對(duì)9種菌株的最低殺菌濃度結(jié)果(mg·mL-1)

4 結(jié)論

通過(guò)丁香苦苷對(duì)9種菌株的MIC、MBC、抑菌圈的直徑測(cè)定，說(shuō)明丁香苦苷具有良好抑菌活性，白色葡萄球菌及肺炎桿菌抑菌作用強(qiáng)，最低抑菌濃度(MIC)為3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1，僅對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌作用不明顯。打孔法丁香苦苷對(duì)除大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌外7個(gè)菌種均出現(xiàn)抑菌環(huán)，與倍比稀釋法結(jié)果一致。丁香苦苷與對(duì)照藥炎立消膠囊和炎可寧片比較可知，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用強(qiáng)于炎可寧片，稍差于炎立消膠囊。與黃連素片對(duì)比，除黃連素片對(duì)銅綠假單胞桿菌強(qiáng)于丁香苦苷外，其余均不及丁香苦苷抗菌效果。由此說(shuō)明，以丁香葉為原料的炎立消膠囊具有廣譜抗菌作用，且作用效果顯著，其有效成分丁香苦苷作用與炎立消膠囊相近，可以推斷丁香苦苷為丁香葉中抗菌的主要有效成分，進(jìn)一步增加了丁香苦苷的藥用范圍。

隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，多種由致病菌引起的細(xì)菌感染性疾病有了很好的控制和治療效果，但抗菌藥物在發(fā)揮強(qiáng)大抗菌功效的同時(shí)，致病菌也不斷對(duì)現(xiàn)有藥物產(chǎn)生耐藥性[11-12]，可供臨床選擇的抗生素越來(lái)越局限，因此，從中藥中篩選抗菌藥物進(jìn)行細(xì)菌的非抗生素治療研究具有重要意義[13]。丁香苦苷毒性極小甚至無(wú)毒[14]，無(wú)不良反應(yīng)，不易產(chǎn)生耐藥性，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，丁香苦苷和炎立消膠囊都是治病殺菌的良藥，通過(guò)本課題的研究為以丁香葉為原料的炎立消膠囊或者片劑體內(nèi)外抗菌作用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為開發(fā)丁香苦苷的抗菌新藥奠定基礎(chǔ)。