厄他培南對(duì)米卡芬凈大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

董劼 劉秀菊 李菲菲 李浩然 張志清

米卡芬凈是侵襲性真菌病治療最常見的抗真菌藥物[1]，血漿蛋白結(jié)合率達(dá)到99.8%，且與其他蛋白結(jié)合率高的藥物相互作用研究不足，以致臨床用藥存在較大風(fēng)險(xiǎn)。米卡芬凈本身存在“矛盾現(xiàn)象”[2]，即指米卡芬凈低濃度時(shí)真菌表達(dá)敏感，但隨著藥物濃度的增加，真菌對(duì)其敏感性卻降低，甚至產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象[3]。侵襲性真菌感染好發(fā)于免疫受損者，如血液惡性腫瘤接受化療者等[4]且大多伴有基礎(chǔ)疾病，患者用藥品種多、作用復(fù)雜[5]。有數(shù)據(jù)顯示，94.7%的住院患者在三甲醫(yī)院中應(yīng)用抗真菌藥物之前都應(yīng)用抗菌藥物，以使用2～3種抗菌藥物的情況最多，所用藥物幾乎涵蓋所有類別的抗菌藥物，包括使用例數(shù)較多的碳青霉烯類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類[6]。而厄他培南作為碳青霉烯類廣譜抗生素，克服之前此類藥物對(duì)脫氫肽水解酶(DHP-1)不穩(wěn)定的缺陷，且由于廣泛的蛋白結(jié)合(85%～95%)作用而具有更長(zhǎng)的半衰期，可以單次給藥[7,8]。當(dāng)米卡芬凈與厄他培南聯(lián)合用于侵襲性真菌感染患者時(shí)，由于二者蛋白結(jié)合率都很高，就有可能會(huì)造成其中一種蛋白結(jié)合能力弱的藥物的游離濃度升高，從而增大不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，甚至降低療效。截至目前，已經(jīng)有一些米卡芬凈鈉與其他藥物之間相互作用的臨床研究，包括霉酚酸酯、環(huán)孢素A[9]、他克莫司、潑尼松龍、西羅莫司、硝苯地平、氟康唑[10]、利托那韋和利福平[11]。其中應(yīng)留意聯(lián)合用藥的不良反應(yīng)，在必要時(shí)可減少西羅莫司或硝苯地平的給藥劑量[12]。作為臨床廣泛應(yīng)用于侵襲性真菌病治療的藥物，米卡芬凈與厄他培南聯(lián)用情況空缺。藥物相互作用信息不完整，在一定程度上限制了此兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用。本研究擬建立簡(jiǎn)便、快捷的高效液相色譜(HPLC)方法，用于測(cè)定大鼠血漿中米卡芬凈的濃度，考察厄他培南對(duì)米卡芬凈在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響，為臨床聯(lián)合用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重(220±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證：SCXK(京)2012-0001，動(dòng)物合格證編號(hào)：11400700144070，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，期間讓其自由飲水飲食。

1.2 儀器與試劑 Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)，包括2489紫外檢測(cè)器，Empower工作軟件；Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；超聲波清洗器(KQ-300B，昆山超聲儀器有限公司)；數(shù)控恒溫水浴氮吹儀(KL512J，北京康林科技有限公司)；高速冷凍醫(yī)用離心機(jī)(R18型，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；高速離心機(jī)(ABBOTT，德國(guó))；渦旋混合器(XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；低溫冰箱(MDF-U2086S，日本SANYO)；旋片式真空泵(FY-2C，浙江飛越機(jī)電有限公司)；電子分析天平(CPA225D，德國(guó)Sartorius)；臺(tái)式酸度計(jì)(HANNA-pH 213，羅馬尼亞)。米卡芬凈原料藥(河北三韻生物科技有限公司，含量99.5%，批號(hào)SL20160123)；艾瑞昔布對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.9%，批號(hào)161104)；注射用米卡芬凈鈉(安斯泰來(lái)制藥有限公司，規(guī)格50 mg，批號(hào)023590)；厄他培南原料藥(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，含量97.0%，批號(hào)181512009)；乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)130701)；醋酸銨(分析純，北京市紅星化工廠，批號(hào)970225-1)；冰乙酸(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)GB/T 676-2007)；高純氮?dú)?含量99.9%，石家莊京聯(lián)實(shí)用氣體有限公司，批號(hào)20160307)；蒸餾水(深圳屈臣氏有限公司)。

1.3 米卡芬凈測(cè)定方法學(xué)的建立

1.3.1 檢測(cè)條件:色譜條件色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L醋酸銨緩沖鹽(冰醋酸調(diào)節(jié)pH值4.5)(42.5:57.5，V/V)；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：269 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl；內(nèi)標(biāo)：艾瑞昔布。

1.3.2 溶液配制:①米卡芬凈對(duì)照品溶液：精密稱量米卡芬凈對(duì)照品適量，用蒸餾水溶解，得濃度為4 mg/ml 的米卡芬凈儲(chǔ)備液，4℃保存待用。取米卡芬凈儲(chǔ)備液適量，精密量取，置量瓶中，蒸餾水定容，得濃度依次為10、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 mg/L的系列對(duì)照品溶液。②內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱量艾瑞昔布對(duì)照品適量，蒸餾水溶解，得濃度為400 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；精密量取艾瑞昔布貯備液適量，用蒸餾水稀釋成200 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，4℃保存待用。

1.3.3 血漿樣品處理:取血漿樣品100 μl，置1.5 ml離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，加乙腈400 μl沉淀蛋白，渦旋混合1 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液10 μl進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.4 專屬性:取米卡芬凈對(duì)照品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖；分別取空白血漿、血漿樣品各100 μl，按“1.2.3”項(xiàng)下處理方法處理(其中空白血漿不加內(nèi)標(biāo))進(jìn)樣并測(cè)定。

1.3.5 最低檢測(cè)限和最低定量限:配制一定濃度的模擬血漿樣品100 μl，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定。以倍比稀釋法配制并依次進(jìn)樣測(cè)定。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:吸取米卡芬凈系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl于1.5 ml離心管中，氮?dú)獯蹈?，分別加入空白血漿100 μl，配制成濃度為1、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/L的模擬血漿樣品。按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄米卡芬凈和艾瑞昔布峰面積。以峰面積比為縱坐標(biāo)，米卡芬凈血漿濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

1.3.7.1 絕對(duì)回收率：取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成米卡芬凈濃度為低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)三種濃度的模擬血漿樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理并分析，記錄米卡芬凈和艾瑞昔布峰面積；另取等量的米卡芬凈對(duì)照品溶液和艾瑞昔布對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積；模擬血漿樣品中米卡芬凈峰面積與進(jìn)樣等量對(duì)照品溶液所得峰面積的比值，即為米卡芬凈的絕對(duì)回收率；模擬血漿樣品中艾瑞昔布峰面積與等量對(duì)照品溶液進(jìn)樣所得峰面積的比值，即為內(nèi)標(biāo)絕對(duì)回收率。

1.3.7.2 相對(duì)回收率：取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成米卡芬凈濃度為低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)三種濃度的模擬血漿樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理并分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算米卡芬凈濃度，該濃度與理論濃度的比值即為相對(duì)回收率。

1.3.8 精密度試驗(yàn):取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成米卡芬凈濃度為低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)的模擬血漿樣品，于1 d內(nèi)處理并測(cè)定，計(jì)算RSD，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d制備、處理并測(cè)定，計(jì)算RSD，考察日間精密度。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.9.1 反復(fù)凍融穩(wěn)定性：取空白血漿6份，制備成米卡芬凈濃度為25 mg/L的模擬血漿樣品，分為2組，每組3份。一組即刻處理后測(cè)定，一組反復(fù)凍融3次后處理后測(cè)定，考察米卡芬凈血漿樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性。

1.3.9.2 低溫保存穩(wěn)定性：取空白血漿6份，制備成米卡芬凈濃度為25 mg/L的模擬血漿樣品，分為2組，每組3份。一組即刻處理后測(cè)定，一組于-40℃保存14 d后處理并測(cè)定，考察米卡芬凈血漿樣品低溫保存穩(wěn)定性。

1.3.9.3 處理血漿樣品放置穩(wěn)定性：取空白血漿3份，制備成米卡芬凈濃度為25 mg/L的模擬血漿樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理后4℃放置0、4、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，考察米卡芬凈血漿樣品處理后放置穩(wěn)定性。

1.4 藥動(dòng)學(xué)研究

1.4.1 給藥方案與血漿樣品處理:米卡芬凈注射液的配制：取注射用米卡芬凈鈉1支(標(biāo)示量50 mg)，用0.9%氯化鈉溶液10 ml溶解，配成5 g/L的米卡芬凈溶液，每次新鮮配制。

1.4.2 厄他培南注射液的配制：取厄他培南原料藥粉末約360 mg，溶于12 ml 0.9%氯化鈉溶液中，得到濃度約為30 g/L的厄他培南溶液，每次新鮮配制。

1.4.3 給藥方案:取SD雄性大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組20只。試驗(yàn)組依次尾靜脈注射厄他培南溶液(相當(dāng)于100 mg/kg厄他培南)和米卡芬凈注射液(相當(dāng)于15 mg/kg米卡芬凈)；對(duì)照組依次尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液和米卡芬凈溶液(相當(dāng)于15 mg/kg米卡芬凈)。分別于給藥后2、10、20、30 min和1、2、4、6、12、24 h于眼內(nèi)眥取血0.5 ml，置于肝素鈉抗凝離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上層血漿，-40℃冰箱保存待測(cè)。

1.4.4 血漿米卡芬凈濃度測(cè)定:待測(cè)血漿室溫解凍，按照“1.2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理并測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算血漿米卡芬凈濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DAS2.1.1軟件對(duì)每只大鼠血漿中米卡芬凈濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)矩?cái)M合，權(quán)重為1/cc，并計(jì)算米卡芬凈主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。應(yīng)用SPSS 13.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件依次將試驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠間主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，若進(jìn)行比較的2組均服從正態(tài)分布，則采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；若其中有一組不服從正態(tài)分布，則選用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性、最低檢測(cè)限和最低定量限:內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾米卡芬凈和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。以S/N≥10時(shí)的血漿藥物濃度作為最低定量限，以S/N≥3時(shí)的血漿藥物濃度作為最低檢測(cè)限。見圖1。

圖1 HPLC圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍:計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0443 X-0.0025，r2=0.9994(n=9)，表明米卡芬凈在1.0～200 mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見圖2。

2.1.3 準(zhǔn)確度：①絕對(duì)回收率：低、中、高三種濃度米卡芬凈模擬血漿樣品的絕對(duì)回收率依次為99.10%，90.10%和95.00%，RSD值依次為4.0%，4.9%和3.7%；內(nèi)標(biāo)絕對(duì)回收率為97.70%，RSD值為4.3%。②相對(duì)回收率：低、中、高三種濃度米卡芬凈模擬血漿樣品的相對(duì)回收率依次為101.7%，108.4%和103.8%，RSD值依次為6.0%，6.7%和7.7%。見表1、2。

2.1.4 精密度:低、中、高三種濃度米卡芬凈模擬血漿樣品的日內(nèi)精密度的RSD值依次為6.3%，7.9%和7.7%；日間精密度RSD值依次為8.4%，8.9%和8.6%。見表3、4。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn):米卡芬凈模擬血漿樣品即刻處理后測(cè)定和反復(fù)凍融3次后處理并測(cè)定，其RSD分別為3.1%和1.6%。且反復(fù)凍融3次后處理測(cè)得濃度為即刻處理后測(cè)得濃度的95.41%。米卡芬凈模擬血漿樣品即刻處理和-40℃保存14 d后處理，其RSD分別

圖2 大鼠血漿中米卡芬凈標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 大鼠血漿中米卡芬凈的絕對(duì)回收率 n=5

表2 相對(duì)回收率實(shí)驗(yàn) n=5

表3 日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn) n=5

表4 日間精密度實(shí)驗(yàn) n=5

為4.0%和3.9%。保存14天后處理測(cè)得濃度為即刻處理測(cè)得濃度的95.62%。米卡芬凈模擬血漿樣品處理后即刻進(jìn)樣測(cè)定與4℃放置0、4、24 h測(cè)定的RSD為7.5%。結(jié)果表明血漿樣品處理后4℃放置穩(wěn)定性良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。見表5、6。

表5 反復(fù)凍融穩(wěn)定性 n=3

表6 -40℃保存14 d穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) n=3

2.2 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與對(duì)照組相比，除了Cmax(P<0.05)，試驗(yàn)組AUC0-24h、AUC0-∞、t1/2、CL和V差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，合用厄他培南前后大鼠體內(nèi)米卡芬凈的藥代動(dòng)力學(xué)受到較小影響。見表7，圖3。

表7 日間精密度實(shí)驗(yàn)

圖3 2組大鼠體內(nèi)米卡芬凈的平均藥時(shí)曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用艾瑞昔布作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行HPLC法測(cè)定大鼠血漿中米卡芬凈的濃度。在流動(dòng)相選擇方面，從乙腈-水體系、甲醇-水體系、乙腈-醋酸鹽體系、甲醇-醋酸鹽體系中選擇，比較后發(fā)現(xiàn)乙腈-醋酸銨作為流動(dòng)相時(shí)的被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物分離度以及峰形良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

血漿樣品處理方法選取蛋白沉淀法。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈2種有機(jī)溶劑,結(jié)果乙腈的蛋白沉淀效果與甲醇相近,但使用甲醇時(shí)會(huì)產(chǎn)生溶劑化效應(yīng),導(dǎo)致色譜峰加寬。鑒于本研究流動(dòng)相為乙腈-醋酸銨，因此采用乙腈為蛋白沉淀劑。綜上，此HPLC法專屬性強(qiáng)、精密度好、準(zhǔn)確度高，可用于測(cè)定大鼠體內(nèi)米卡芬凈血藥濃度。

由于藥物在血液中存在多重平衡，例如，游離藥物與血漿蛋白結(jié)合藥物的平衡、游離藥物與組織藥物的平衡以及游離藥物和血細(xì)胞內(nèi)藥物的平衡等；厄他培南與米卡芬凈合用后，米卡芬凈血漿Cmax降低，但是其余參數(shù)幾乎不變，根據(jù)得到的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和藥時(shí)曲線，由此可以認(rèn)為厄他培南對(duì)米卡芬凈的藥動(dòng)學(xué)基本無(wú)影響。

另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血液中可結(jié)合的白蛋白數(shù)量減少會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞內(nèi)米卡芬凈藥物濃度的增大[13]，即加速了米卡芬凈從血漿轉(zhuǎn)移至血細(xì)胞內(nèi)的過程。可推測(cè)，由于厄他培南的血漿蛋白結(jié)合率很高，先于米卡芬凈占據(jù)了大部分白蛋白，因此造成了米卡芬凈進(jìn)入血液后只有很少的白蛋白可以結(jié)合的情況，從而造成更多的游離米卡芬凈向血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，而游離血藥濃度的升高也會(huì)加速藥物進(jìn)入其他組織部位。Petraitis等[14]，也得到類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，米卡芬凈與拉夫康唑合用使得拉夫康唑Cmax上升而其余藥動(dòng)學(xué)參數(shù)未改變，遺憾的是他們并未對(duì)此作出解釋或推測(cè)?？紤]到以上問題，有必要深入研究厄他培南對(duì)米卡芬凈相互之間蛋白結(jié)合力的強(qiáng)弱以及在人血漿中的情況，為米卡芬凈人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供更多的理論依據(jù)進(jìn)而為臨床用藥提供參考。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法可準(zhǔn)確快速測(cè)定大鼠血漿中的米卡芬凈藥物濃度。厄他培南與米卡芬凈合用后，由于米卡芬凈在血液中存在游離型與結(jié)合型的相互轉(zhuǎn)化以及血細(xì)胞內(nèi)外的藥物濃度變化使得厄他培南對(duì)米卡芬凈的藥動(dòng)學(xué)影響很小。