長鏈非編碼RNA NRON促進(jìn)NFATc3磷酸化減輕心房纖維化的機(jī)制研究

王 澤，郭志祥，葛圣林

心房纖顫(atrial fibrillation, AF)是目前最常見的心律不齊之一，AF發(fā)作會造成血流動力學(xué)改變，極易引起血栓的形成。所以AF是引發(fā)中風(fēng)、心力衰竭和死亡的重要危險因素。由于AF對醫(yī)療系統(tǒng)帶來的負(fù)擔(dān)持續(xù)上升，因此臨床醫(yī)師準(zhǔn)確鑒別出高風(fēng)險的AF患者并及時采取預(yù)防和治療手段已變得至關(guān)重要?；罨疶細(xì)胞因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)是一種受Ca2+調(diào)節(jié)以控制基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族。越來越多的數(shù)據(jù)表明鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)/ NFAT信號通路在心臟肥大和纖維化中起重要作用[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding ribonucleic acid , LncRNA)是一組非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，長度大于200個核苷酸?，F(xiàn)國外尚未有研究結(jié)果證實NRON對于NFAT的具體作用機(jī)制，該研究探討LncRNA NRON影響NFAT的具體機(jī)制及其對心肌纖維化進(jìn)程的影響，從而為臨床預(yù)測和治療AF提供了新的可行性。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018～2019年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科包括心臟瓣膜置換術(shù)在內(nèi)的34例AF患者(AF組)和20例竇性心律(sinus rhythm, SR)患者(SR組)。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：服用抗心律失常藥物(β受體阻滯劑除外)的AF患者或有其他心律不齊病史的患者；植入永久起搏器的患者；既往或計劃進(jìn)行Cox迷宮手術(shù)的患者；中重度二尖瓣疾病患者；有二尖瓣置換術(shù)手術(shù)史患者；先天性心臟畸形患者；急診手術(shù)患者；全身性炎癥或癌癥患者；人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染或營養(yǎng)不良患者。在收集入組患者組織樣本時，所有患者未接受過皮質(zhì)類固醇或非類固醇抗炎藥治療。本研究得到安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院人類倫理委員會的批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵守《赫爾辛斯基宣言》實施試驗，并獲得了所有入組患者或其直系家屬的書面知情同意。

1.2 主要試劑胎牛血清(上海斯信生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國R&D Systems公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)； troponin IF一抗、vimentin IF一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；IF二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；vimentin免疫印跡一抗、troponin免疫印跡一抗(武漢莫納生物科技有限公司)，GAPDH免疫印跡一抗、免疫印跡二抗(上海斯信生物科技有限公司)，引物(美國Thermo Fisher Scientific公司)；熒光定量 PCR 試劑盒(日本Takara公司)；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純化。

1.3 主要方法

1.3.1細(xì)胞分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 術(shù)中從SR患者中取出心臟組織，并在PBS培養(yǎng)基中洗滌。膠原酶和蛋白酶消化后，將原發(fā)性心房成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。3次傳代后，收集細(xì)胞，更換培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。之后將pcDNA-NRON和si-NRON轉(zhuǎn)染至原代心房成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于進(jìn)一步實驗。

1.3.2qRT-PCR 提取總RNA。對High Capacity cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后在PCR檢測儀上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，選擇GAPDH作為內(nèi)參。 數(shù)據(jù)是針對每個cDNA標(biāo)準(zhǔn)化為參考基因GAPDH樣品。本研究中使用的引物序列包括： NRON forward:5′-AC GTTCCTTAATGTACGCCTTTGC-3′，reverse: 5′-TTGG CCGTGTCCTGAGTCCTT-3′；Collagen Ⅰ forward：5′-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3′，reverse：5′-CCACGT CTCACCATTGGGG-3′；Collagen Ⅲ forward：5′-TTTTG CAGTGATATGTGATGTT-3′，reverse：5′-GGATGGTGG TTTTCAGTTTA-3′。

1.3.3免疫組織化學(xué) 將組織分離物制成4 μm石蠟切片，然后進(jìn)行脫蠟并通過分級乙醇水化。 孵育切片并用PBS沖洗后進(jìn)行抗原恢復(fù)。然后加入膠原蛋白Ⅰ一抗(1 ∶200)，在4 ℃下孵育過夜并用PBS沖洗，然后添加第二種抗體在37 ℃下孵育2 h并用PBS沖洗。染色后用水洗滌。將它們在梯度乙醇系列和二甲苯中脫水，然后覆蓋。最后用顯微鏡觀察免疫組織化學(xué)結(jié)果。

1.3.4Western blot 使用RIPA裂解緩沖液從成纖維細(xì)胞中提取總蛋白，并用BCA套件進(jìn)行定量檢測。將等體積的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜, 孵育一抗 (1 ∶500) , 4 ℃搖床過夜。二抗 (1 ∶5 000) 孵育, 洗膜, ECL發(fā)光法顯影。

1.3.5免疫熒光染色 首先用PBS處理成纖維細(xì)胞，在室溫下用0.5%Triton X-100處理20 min，再沖洗3次，1%BSA封閉過夜，波形蛋白抗體(1 ∶100)和肌鈣蛋白抗體(1 ∶100)在4 ℃孵育過夜，用PBS沖洗3次，每次2 min。將制劑在37 ℃下溫育30 min，然后將PBS漂洗3次,將DAPI ∶緩沖液按1 ∶1 000配置DAPI工作液，在每張玻璃片上都滴加DAPI工作液，室溫下避光孵育5 min，對細(xì)胞爬片進(jìn)行核染，然后使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6CCK-8增殖實驗 常規(guī)消化與不同來源的成纖維細(xì)胞，接種于96孔板，每孔3 000個細(xì)胞，CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染pcDNA-NRON和si-NRON后的成纖維細(xì)胞增殖能力，使用未參與轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞作為對照。將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，每組的樣本設(shè)5個重復(fù)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待檢測前每孔中加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度值，以溶劑處理的細(xì)胞為對照組，不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白組，按公式計算細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.3.7HE染色和Masson染色 收集入組樣本組織并固定在4%中性多聚甲醛中，進(jìn)行石蠟包埋。常規(guī)使用蘇木精/伊紅(HE)染色以進(jìn)行組織學(xué)檢查。同時，使用Masson三色染色法，對心房組織內(nèi)的纖維組織進(jìn)行定位。使用Image-Pro plus分析系統(tǒng)對纖維化進(jìn)行半定量評估。

1.3.8動物實驗 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只：正常對照組(control組)、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的纖維化組(Ang-Ⅱ組)、 Ang-Ⅱ+pcDNA組和Ang-Ⅱ+ pcDNA-NRON組。經(jīng)腹膜注射Ang-Ⅱ 1.5 μg/g/d，持續(xù)4周，同時對Ang-Ⅱ+pcDNA組和Ang-Ⅱ+pcDNA-NRON組小鼠經(jīng)尾靜脈注射pcDNA和pcDNA-NRON。2周后，將小鼠麻醉并取出心臟組織進(jìn)行進(jìn)一步分析。所有動物實驗均得到安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 AF患者心房組織中LncRNA NRON的表達(dá)和心房纖維化蛋白的表達(dá)為了研究lncRNA NRON在AF患者中的表達(dá)，收集了AF組和SR組患者的心房組織。與SR患者比較，AF的心房組織中NRON表達(dá)明顯降低，見圖1A。根據(jù)紐約心臟協(xié)會(NYHA)制定標(biāo)準(zhǔn)，將34例AF患者分為不同的病理等級(Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)(圖1B)。AF患者心房組織中NRON的mRNA水平顯著降低。檢測心房纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，AF心房中膠原Ⅰ和膠原Ⅲ表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖1C～E)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示AF心房組織中膠原Ⅰ在心肌間質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管基底膜中的表達(dá)和分布比SR心房組織中更廣泛(圖1F)。

2.2 LncRNA NRON過表達(dá)對心房纖維化的影響從SR患者的心房組織中分離出了心房成纖維細(xì)胞，并在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過免疫熒光染色得出的結(jié)果表明波形蛋白(vimentin)高表達(dá)和肌鈣蛋白(troponin)低表達(dá)(圖2A)。用pcDNA-NRON或siRNA NRON轉(zhuǎn)染心房成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率如圖2B所示，用pcDNA-NRON轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中NRON的表達(dá)高于用pcDNA-vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞，NRON在si-NRON中的表達(dá)較低。使用Ang-Ⅱ誘導(dǎo)纖維化后使用CCK-8進(jìn)行增殖能力檢測，結(jié)果顯示NRON過表達(dá)抑制了成纖維細(xì)胞增殖，而si-NRON促進(jìn)了增殖(圖2C)。過度表達(dá)的NRON明顯抑制了Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)，而si-NRON組與pcDNA組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2D)。NRON明顯誘導(dǎo)NFATc3磷酸化，從而導(dǎo)致Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中p-NFATc3 / NFATc3的比例升高(圖2D、E)。如圖2F所示，藍(lán)綠色重疊表示成纖維細(xì)胞核中的NFATc3表達(dá)，Ang-Ⅱ處理組的NFATc3表達(dá)比對照組多，NRON過表達(dá)抑制了NFATc3從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.3 過表達(dá)LncRNA NRON對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化影響在動物實驗結(jié)束時測試了小鼠的心臟功能水平和相關(guān)的血液動力學(xué)指標(biāo)，結(jié)果表明NRON過表達(dá)組顯著抑制了Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的左室舒張末期直徑(left ventricular end distolicdimension,LVDd)、左室收縮末期直徑 (left ventricular end-systolicdimension,LVDs)、室間隔舒張末期厚度(inter-ventricular septal thickness at diastole，IVSd)、室間隔收縮末期厚度 (interventricular septal thickness at end-systole，IVSs) 的增加，并顯著促進(jìn)了Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室射血縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fraction shortening，LVFS)降低(表1)。HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，Ang-Ⅱ組心肌間質(zhì)纖維紊亂的發(fā)生率更高，而核與核之間的距離更寬，但是pcDNA-NRON減輕了纖維化的發(fā)生率，使心肌間質(zhì)纖維減少(圖3A)。通過Masson染色檢測心肌纖維化的程度，結(jié)果如圖3B所示，Ang-Ⅱ組心肌纖維明顯增厚且膠原纖維沉積很多。然而，pcDNA-NRON使心肌之間纖維減少變薄，從而改善纖維化。同時，膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、NFATc3和p-NFATc3的蛋白質(zhì)水平結(jié)果顯示NRON過表達(dá)組顯著減少了Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心房組織膠原Ⅰ和膠原Ⅲ和NFATc3的表達(dá)(圖3C、D)。此外，NRON過表達(dá)株顯著提高了NFATc3的磷酸化水平，導(dǎo)致p-NFATc3/NFATc3的比例增加(圖3E、F)。以上的動物實驗數(shù)據(jù)顯示，過表達(dá)的NRON抑制了小鼠的心臟纖維化。

圖1 AF中NRON表達(dá)和心房纖維化蛋白表達(dá)

圖2 過表達(dá)NRON對心房成纖維細(xì)胞纖維化影響

表1 過表達(dá)NRON對小鼠心臟功能和血液動力學(xué)的影響

3 討論

LncRNA已顯示在許多心臟發(fā)育或心臟疾病中起關(guān)鍵作用[3]。LncRNA是一組非蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，長度大于200個核苷酸。LncRNA在過去曾被認(rèn)為并不具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯的作用。但如今越來越多的證據(jù)支持LncRNA在健康和疾病中對基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義[4]，它們已經(jīng)參與了許多生物學(xué)過程，例如表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分化、剪接、核/細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸以及轉(zhuǎn)錄/翻譯。最近，在心臟和血管系統(tǒng)中已經(jīng)證明存在有幾種與調(diào)節(jié)功能相關(guān)的LncRNA，包括Braveheart、Fendrr、CHRF、MALAT、LIPCAR和SENCR[5-7]。但是，還需要研究其他與AF相關(guān)的LncRNA以便更好地了解AF的發(fā)病機(jī)制。

NFAT是一種受Ca2+調(diào)節(jié)以控制基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族，首次被發(fā)現(xiàn)于T淋巴細(xì)胞。NFAT的顯著特征是其受Ca2+和依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白的絲氨酸磷酸鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)。CaN是一種依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白的磷酸酶，可將大量的磷酸蛋白去磷酸化[1]。盡管該酶在多種類型的組織和細(xì)胞中表達(dá)，但其與NFAT轉(zhuǎn)錄因子家族的核定位轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[2]。

有實驗[8]表示NRON在心肌組織中表達(dá)水平較高，并已通過影響其核運(yùn)輸而被認(rèn)為是NFAT的阻遏物。本研究，根據(jù)qRT-PCR分析得出結(jié)論，相對于SR組，AF組患者心房組織樣本lncRNA NRON的表達(dá)水平較低。已知NFAT是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和基因表達(dá)的關(guān)鍵蛋白，在心臟疾病中其表達(dá)和活性發(fā)生了很大變化。Sharma et al[9]發(fā)現(xiàn)敲除LncRNA NRON的細(xì)胞里出現(xiàn)NFAT的去磷酸化和核易位的大量增加，這與本研究關(guān)于AF中NRON增強(qiáng)的NFATc3磷酸化的發(fā)現(xiàn)一致。NRON對NFAT脫磷酸作用的抑制作用先前歸因于其螯合參與核轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)的能力，特別是KPNB1、importin-beta和CSE1L，后者將importin-alpha從細(xì)胞核循環(huán)到細(xì)胞質(zhì)。

磷酸化的NFAT1存在于大的細(xì)胞質(zhì)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物中，該復(fù)合物包含支架蛋白，包含GTPase活化蛋白(IQGAP)，鈣調(diào)蛋白和3個NFAT激酶的IQ基序，酪蛋白激酶1，糖原合酶激酶3和雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶。NRON和IQGAP1的組合敲低增加了刺激后NFAT的去磷酸化和核輸入。支架復(fù)合物不僅將NFAT定位在促進(jìn)其在細(xì)胞質(zhì)中處于失活狀態(tài)的維持激酶附近，而且還可能阻礙鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在靜息細(xì)胞中接近NFAT，并且還可以作為核轉(zhuǎn)運(yùn)因子和所需鈣調(diào)蛋白的儲庫在刺激的細(xì)胞中激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶。此外，NRON還通過以下途徑抑制成纖維細(xì)胞增殖抑制NFAT活性，這一結(jié)果與腫瘤細(xì)胞的作用一致[10]。結(jié)合以上結(jié)論分析，作為NFAT的阻遏物，NRON是AF中一種抑制纖維化的LncRNA，并可以影響AF的進(jìn)展過程。

本研究揭示了NRON與AF和心房心肌的纖維化進(jìn)程有關(guān)。此外，驗證了NRON抑制成纖維細(xì)胞的增殖以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)。臨床證據(jù)和體外分析均表明NRON可通過促進(jìn)AF中NFATc3磷酸化來減輕心房纖維化。這一發(fā)現(xiàn)為AF在分子層面的發(fā)展機(jī)制提供了新的見解，有望為AF治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

圖3 過表達(dá)NRON對Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化影響