利拉魯肽通過(guò)自噬及改善氧化應(yīng)激緩解大鼠糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松

楊 婧，楊麗娜，丁庭庭，鐘 興，潘天榮

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(glucocortieoid-induce osteoporosis，GIOP)作為最常見(jiàn)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松類型，在長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)治療的患者中發(fā)病率高達(dá)30%～50%，已成為一個(gè)十分嚴(yán)峻的全球健康問(wèn)題[1]。胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide-1，GLP-1)是腸促胰素的一種，近年來(lái)一些研究顯示,它不但能夠作用于胰臟，與骨代謝也密切相關(guān)[2]。其類似物利拉魯肽對(duì)骨骼有正性作用，但是具體機(jī)制尚不明確[3]。該研究建立GIOP大鼠模型，使用利拉魯肽進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)分析骨密度(bone mineral density,BMD)、骨微結(jié)構(gòu)、自噬(autophagy)及氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)水平的變化，探討利拉魯肽對(duì)GIOP的影響，并初步討論其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(220±10) g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：標(biāo)準(zhǔn)鼠籠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，溫度(23.0±2.0)℃，濕度(55±5)%，光照時(shí)間7：00～19：00，通風(fēng)環(huán)境良好，每周更換2次墊料，每12 h添加飼料及水1次，不限制大鼠攝食及飲水。

1.1.2主要藥物、器材與試劑 地塞米松(石藥銀湖制藥有限公司)；利拉魯肽(丹麥諾和諾德公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS) 測(cè)定試劑盒、丙二醛(malonaldehyde， MDA) 測(cè)定試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(萬(wàn)類生物公司) ；Beclin-1抗體、Atg5抗體、LC3B抗體、p62/SQSTM1W抗體及β-actin(碧云天生物公司)；Micro-CT(美國(guó)通用公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的建立 所有雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用數(shù)字表法隨機(jī)平均分為地塞米松組(DXM組)、地塞米松加利拉魯肽干預(yù)組(DXM+Lira組)及正常對(duì)照組(CON組)，每組各10只，全程藥物干預(yù)12周，具體方式如下：① CON組：給予0.1 ml生理鹽水每日肌肉注射；② DXM組：按照1 mg/kg劑量配置成0.1 ml地塞米松溶液每周2次肌肉注射;③ DXM+Lira組: 在相同劑量及頻率地塞米松溶液注射的同時(shí)，給予利拉魯肽200 μg/kg劑量每日皮下注射。每周定時(shí)對(duì)所有大鼠進(jìn)行體質(zhì)量測(cè)定，并根據(jù)其數(shù)值變化相應(yīng)地調(diào)整藥物的使用劑量。

1.2.2樣本收集 于實(shí)驗(yàn)12周末，使用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，心房放血處死大鼠后收集雙側(cè)股骨，剔除全部附著肌肉、軟組織及骨髓，包裹生理鹽水紗布置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3Micro-CT檢測(cè)BMD、骨微結(jié)構(gòu) 將左側(cè)股骨室溫下解凍后固定于樣品固定器內(nèi)，以15 μm的分辨率行Micro-CT掃描并行組織結(jié)構(gòu)重建。得到重建圖像后，使用自帶軟件定量分析得到BMD、骨小梁體積比率(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)和骨小梁連接密度(connectivity density, Conn.D)參數(shù)。

1.2.4試劑盒檢測(cè)骨組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 取大鼠右側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨組織，放入液氮中反復(fù)研磨直至粉末狀，加入PBS后使用1 000g離心10 min收集上清液，按照說(shuō)明書(shū)使用試劑盒測(cè)定ROS、SOD及MDA含量。

1.2.5蛋白免疫印跡(Western blot)分析自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 取大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織粉末，使用Western及IP細(xì)胞裂解液提取干骺端總蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后與特異性抗體孵育，曝光顯影后通過(guò)灰度分析Beclin-1、Atg5、p62/SQSTM1W及Map1-LC3-Ⅱ的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 骨組織Micro-CT分析Micro-CT下股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果顯示，與CON組比較，DXM組大鼠BMD降低，BV/TV下降，Tb.N減少，Tb.Th變薄，Tb.Sp增寬，連接變差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在利拉魯肽干預(yù)下，DXM+Lira組較DXM組BMD增加，骨小梁變多變粗變密，連接改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 骨組織氧化應(yīng)激水平變化與CON組比較，DXM組大鼠骨組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS和MDA水平增加，抗氧化酶SOD水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DXM組比較，DXM+Lira組大鼠骨組織ROS和MDA水平下降，SOD水平上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2 。

2.3 骨組織自噬水平變化與CON組比較，DXM組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ表達(dá)水平上升，p62/SQSTM1W蛋白表達(dá)水平略有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DXM組比較，DXM+Lira組Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平下降，p62/SQSTM1W蛋白表達(dá)水平略有上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 鼠左側(cè)股骨Micro-CT結(jié)果

表2 股骨組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)變化

圖1 大鼠骨組織Beclin-1、Atg5、p62 及LC3 Ⅱ的蛋白表達(dá)變化與CON組比較:*P<0.05；與DXM組比較:#P<0.05

3 討論

利拉魯肽是一種利用酵母生產(chǎn)的人工合成長(zhǎng)效GLP-1類似物，與天然GLP-1具有97%的序列同源性，可通過(guò)多種方式作用于骨骼并具有保護(hù)作用[4]。Mansur et al[5]發(fā)現(xiàn),在GIOP小鼠模型中,利拉魯肽可以預(yù)防骨丟失,延緩骨質(zhì)疏松進(jìn)程。另有研究[6]表明,利拉魯肽對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型也有增加BMD,改善骨結(jié)構(gòu)等作用。本研究及前期研究[7]結(jié)果與其一致,經(jīng)Micro-CT掃描，DXM組的大鼠較CON組BMD下降，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D下降，提示骨小梁變少變疏變細(xì)，骨質(zhì)疏松模型造模成功。在利拉魯肽干預(yù)下，與DXM組比較，大鼠BMD增加，Tb.Th、Conn.D增加，提示骨小梁微結(jié)構(gòu)得到改善，說(shuō)明利拉魯肽可以增加BMD、防止骨微結(jié)構(gòu)的破壞,對(duì)GIOP具有一定的改善作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)可以抑制成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)其凋亡,誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞的增殖分化并提高其活性，對(duì)維持骨代謝平衡十分重要[8]。在高劑量糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)下,機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基水平高于細(xì)胞的抗氧化防御能力,過(guò)量的活性氧ROS存在于組織或細(xì)胞內(nèi)將誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),并直接或間接導(dǎo)致氧化損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[9]，相較對(duì)照組，GIOP家兔模型的BMD下降，血清自由基水平升高,抗氧化酶活性降低,當(dāng)注射抗氧化劑干預(yù)后,可有效地逆轉(zhuǎn)上述改變。本研究結(jié)果與之相符，與CON組比較，DXM組大鼠骨組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS、MDA水平均上升，抗氧化酶SOD水平下降，說(shuō)明大鼠氧化應(yīng)激水平升高，且出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松，其可能原因是地塞米松引起了氧化應(yīng)激損傷從而導(dǎo)致了骨代謝失衡。在利拉魯肽干預(yù)下，相較于DXM組，大鼠氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS、MDA水平均下降，抗氧化酶SOD水平上升，且BMD及骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)好轉(zhuǎn)，提示利拉魯肽可能通過(guò)改善氧化應(yīng)激緩解大鼠GIOP的程度。

自噬對(duì)骨代謝及其相關(guān)重要細(xì)胞也有重要影響，適度的自噬可以使骨細(xì)胞保持功能，但是過(guò)度的自噬則會(huì)激活調(diào)亡或轉(zhuǎn)換為自噬性死亡導(dǎo)致骨代謝紊亂[10]。有研究[11]表明低劑量的GC可以誘導(dǎo)骨細(xì)胞自噬，具有保護(hù)作用；高劑量的GC會(huì)引起成骨細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降。本研究結(jié)果與之符合，DXM組大鼠較CON組自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均升高,p62/SQSTM1W蛋白表達(dá)水平略有下降，并伴BMD下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞。相較于DXM組,利拉魯肽干預(yù)組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ的表達(dá)水平下降,p62/SQSTM1W蛋白表達(dá)水平略有上升，且大鼠BMD增加，骨微結(jié)構(gòu)改善，提示利拉魯肽可能通過(guò)調(diào)整自噬水平，改善大鼠BMD與骨微結(jié)構(gòu)。

氧化應(yīng)激反應(yīng)與自噬對(duì)于骨代謝都十分重要，并且這兩者關(guān)系密切，互相作用。一方面，氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物ROS可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)自噬[12]。在自噬的誘導(dǎo)階段中，過(guò)量的ROS可以抑制PI3K-Akt-mTOR從而激活自噬。在自噬體形成過(guò)程中，ROS可以通過(guò)抑制Atg4的活性引起LC3-Ⅱ堆積，使得自噬體增多從而促進(jìn)自噬。在饑餓條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS可以氧化Atg4抑制LC3-Ⅱ去脂化從而保證自噬體延伸。ROS還能促進(jìn)待降解物質(zhì)的泛素化修飾，使待降解物與p62 及LC3-Ⅱ泛素化結(jié)合從而易于被自噬。另一方面，自噬可以抑制氧化應(yīng)激及其造成的損傷[13]。作為氧化應(yīng)激的直接引物，約90%的ROS產(chǎn)生于線粒體內(nèi)膜呼吸鏈，持久嚴(yán)重的氧化應(yīng)激將造成線粒體損傷從而產(chǎn)生更多的ROS。通過(guò)清除損傷的線粒體,自噬可以直接調(diào)控ROS水平。實(shí)驗(yàn)[14]表明，用脂多糖刺激心肌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量ROS繼而損傷線粒體，通過(guò)線粒體自噬則能及時(shí)清除受損線粒體并降低ROS水平。此外，自噬還可以通過(guò)修復(fù)損傷的DNA以避免氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞死亡。有研究[15]表明，敲除自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5及Atg7將導(dǎo)致DNA損傷累積，加速細(xì)胞死亡。

氧化應(yīng)激對(duì)于自噬的調(diào)節(jié)功能呈現(xiàn)兩面性,自噬對(duì)于骨代謝也存在雙重影響。少量的ROS可以激活自噬，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷自噬可以減少成骨細(xì)胞凋亡，大量的ROS則會(huì)導(dǎo)致過(guò)度自噬，從而激活凋亡或者轉(zhuǎn)換為自噬性死亡。因而在本研究中，DXM組自噬水平增高，但是并未通過(guò)提高自噬水平阻止BMD下降及骨微結(jié)構(gòu)破壞，其可能原因是大劑量的地塞米松引起了氧化應(yīng)激損傷并直接導(dǎo)致了骨代謝的失衡，氧化應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的過(guò)量活性氧ROS又引起了過(guò)度自噬誘發(fā)成骨細(xì)胞凋亡從而進(jìn)一步加劇了骨質(zhì)疏松。在利拉魯肽干預(yù)下，大鼠骨組織內(nèi)活性氧ROS以及脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物MDA的表達(dá)減少,抗氧化酶SOD的活性增加，部分自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低，BMD及骨微結(jié)構(gòu)改善，提示利拉魯肽可能是通過(guò)改善氧化應(yīng)激水平并調(diào)整細(xì)胞自噬，從而起到緩解骨質(zhì)疏松作用。

綜上所述，利拉魯肽改善由GC誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松，推測(cè)其可能與改善氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)自噬有關(guān)，但確切的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究深入探討。