125I粒子對(duì)膽管細(xì)胞癌HCCC-9810細(xì)胞凋亡及Livin基因表達(dá)的影響

杜小麗，劉兆玉，賀 倩，林 偉

人類膽管細(xì)胞癌來源于膽管上皮細(xì)胞，可發(fā)生在肝內(nèi)外膽管的任何部位[1]。近幾年來，膽管細(xì)胞癌是肝臟最常見惡性腫瘤，且發(fā)生率逐漸增高[2]。由于治療方式選擇的限制及大部分病例確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，膽管細(xì)胞癌的存活率相當(dāng)?shù)蚚3]。放療是膽管細(xì)胞癌非手術(shù)治療方式之一，粒子植入治療方式屬于放療中的一種。Schoenthaler et al[4]認(rèn)為針對(duì)病理檢查提示切緣陽(yáng)性者，術(shù)后輔助放療尤其是植入粒子放療，有效緩解腫瘤痛的同時(shí)，能獲得較單純手術(shù)更好的預(yù)后。此外，Moon et al[5]進(jìn)行的膽管癌體外研究發(fā)現(xiàn)，膽管細(xì)胞癌具有顯著的放射抵抗性。Livin作為新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性存在著一定的影響。因此，該研究將探討125I粒子對(duì)人膽管細(xì)胞癌HCCC-9810 細(xì)胞Livin基因的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，不僅能為膽管細(xì)胞癌細(xì)胞Livin基因功能及膽管細(xì)胞癌放射抵抗性探討提供一些實(shí)驗(yàn)佐證，還可為臨床膽管細(xì)胞癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料人膽管細(xì)胞癌HCCC-9810細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；Annexin V/PI雙染試劑購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；濃縮型DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa生物工程有限公司；125I粒子購(gòu)于北京同輻公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為：空白對(duì)照組、空殼組、0.5 mCiGy125I粒子組、0.7 mCiGy125I粒子組、0.9 mCiGy125I粒子組。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)用含12%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)膽管細(xì)胞癌HCCC-9810細(xì)胞。0.25%胰蛋白酶?jìng)鞔?，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(培養(yǎng)48 h后)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。參照文獻(xiàn)[6]描述的方法操作。

1.5 免疫組化法檢測(cè)Livin蛋白的表達(dá)對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔。按照說明書進(jìn)行，Livin的一抗?jié)舛葹? ∶200。用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)采集圖片，測(cè)平均灰度值及平均光密度值。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Livin的mRNA的表達(dá)對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)24個(gè)復(fù)孔。參照文獻(xiàn)[7]描述的方法操作，用PTC-100型PCR儀( 美國(guó)M J Research 公司 ) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增和觀察。

2 結(jié)果

2.1125I粒子誘導(dǎo)各組膽管細(xì)胞癌HCCC-9810凋亡率的變化利用流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，見圖1，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，空殼組細(xì)胞凋亡率無改變，125I粒子處理均能誘導(dǎo)HCCC-9810細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=185.09，P<0.05)，其中0.5 mCiGy125I粒子實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡比例最高，0.7 mCiGy125I粒子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率水平最低。

2.2 免疫組化檢測(cè)Livin蛋白分布、表達(dá)的變化結(jié)果如圖2所示：125I粒子可誘導(dǎo)膽管細(xì)胞癌HCCC-9810細(xì)胞中Livin蛋白含量增加，其中，0.7 mCiGy125I粒子實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=98.017，P<0.05)。此外，Livin蛋白主要分布在細(xì)胞胞質(zhì)中，細(xì)胞核可見少量表達(dá)。

2.3 各組HCCC-9810細(xì)胞中Livin 蛋白和mRNA的變化分別利用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)各組HCCC-9810細(xì)胞中Livin mRNA和蛋白的變化，結(jié)果如圖3所示：與空白對(duì)照組比較，空殼組中Livin基因和蛋白水平無變化，但125I粒子處理可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Livin mRNA(F=84.132，P<0.05)和蛋白(F=285.893，P<0.05)的表達(dá)，且兩者的變化趨勢(shì)相一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中，0.7 mCiGy125I粒子組中Livin表達(dá)最多；此外，我們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)可被125I粒子磷酸化激活，其激活水平與Livin表達(dá)相一致，提示Akt的活化可能參與膽管癌細(xì)胞內(nèi)Livin的表達(dá)。

圖1 125I粒子誘導(dǎo)膽管細(xì)胞癌HCCC-9810細(xì)胞凋亡率增加

圖2 125I粒子上調(diào)膽管細(xì)胞癌HCCC-9810細(xì)胞中Livin蛋白表達(dá)

圖3 125I粒子增加膽管細(xì)胞癌HCCC-9810細(xì)胞中Livin mRNA和蛋白的表達(dá)

3 討論

膽管細(xì)胞癌由于其治療方式選擇的限制及大部分病例確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，預(yù)后較差且存活率偏低[8]。既往介入化療栓塞術(shù)或化療灌注術(shù)為無法手術(shù)的進(jìn)展期膽管細(xì)胞癌的主要治療手段，但考慮膽管細(xì)胞癌多為乏血供腫瘤，介入化療栓塞術(shù)或化療灌注術(shù)也不能明顯提高患者生存期[9]。

125I粒子治療腫瘤的機(jī)制之一是利用其釋放出的γ射線破壞腫瘤細(xì)胞的DNA雙鏈，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制有絲分裂而殺死細(xì)胞[10]。Livin基因作為凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員之一，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性產(chǎn)生一定的影響。已有研究[11]發(fā)現(xiàn)，Livin基因的表達(dá)狀況與惡性腫瘤患者放射治療及化療療效有一定的相關(guān)性。湯志華 等[12]通過免疫組化法檢測(cè)膽管細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中Livin蛋白的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅膽管細(xì)胞癌組織及膽管細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)Livin蛋白，癌旁組織及非腫瘤細(xì)胞中無Livin蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與空殼組中膽管細(xì)胞癌細(xì)胞內(nèi)Livin基因的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示空殼對(duì)膽管細(xì)胞癌Livin基因的表達(dá)影響不大，但細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)輕度增加(差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，這可能與空殼鈦金屬材質(zhì)改變了細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境所致有關(guān)。然而，3組125I粒子實(shí)驗(yàn)組中的細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，可能與置入125I粒子后改變細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境及125I粒子釋放出γ射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)；同時(shí)，3組中Livin蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組及空殼組增加，表明膽管細(xì)胞癌具有一定的放射抵抗性，進(jìn)一步佐證了Moon et al[5]的研究結(jié)果。

本研究還發(fā)現(xiàn)，125I粒子誘導(dǎo)HCCC-9810細(xì)胞內(nèi)Livin表達(dá)和125I粒子誘導(dǎo)HCCC-9810細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，即Livin表達(dá)越高，細(xì)胞凋亡發(fā)生率越低，0.7 mCiGy125I粒子誘導(dǎo)HCCC-9810細(xì)胞Livin基因表達(dá)的能力最強(qiáng)?？紤]到Livin作為重要的凋亡抑制基因，在各種惡性腫瘤中特異性高表達(dá)，如肺癌、黑色素瘤等[13-14]，已有學(xué)者認(rèn)為其可作為抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[15]。但目前僅有少數(shù)體外細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)膽管細(xì)胞癌中Livin的存在，考慮體內(nèi)外分子調(diào)控環(huán)境差異，現(xiàn)有相關(guān)研究尚存在一定的欠缺，故亟需建立膽管細(xì)胞癌動(dòng)物模型以進(jìn)一步論證上述結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)125I粒子可誘導(dǎo)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡及Livin基因的表達(dá)，同時(shí)也從基因和蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證膽管細(xì)胞癌放射抵抗性可能與Livin的表達(dá)水平有一定的相關(guān)性，提示Livin可作為膽管細(xì)胞癌放射抵抗性的判斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。