普魯卡因抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與DNA甲基化

朱 波，解 爽，張思瑩，陳 淵，胡漫輝，溫聰娜，劉偉華，問 明，張 濤，劉經(jīng)緯，李日恒

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率近年來均保持上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制之一，在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域CpG島高甲基化導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄沉默已被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的一個(gè)共同特征[5-6]，由此通過去甲基化藥物使抑癌基因重新表達(dá)為腫瘤治療提供了新的思路和途徑。普魯卡因(procaine，PCA)作為一種新型去甲基化劑，在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7[7]、胃癌細(xì)胞系SGC-7901[8]中具有生長抑制的作用。然而，PCA對結(jié)腸癌細(xì)胞DNA甲基化調(diào)節(jié)以及生物學(xué)功能的影響鮮見報(bào)道，該研究以人結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細(xì)胞作為研究對象，探討 PCA對Septin9基因甲基化狀態(tài)和表達(dá)水平的影響及其抑制細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1購于武漢普諾賽生命科技有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購于石家莊華沃科瑞生物科技有限公司；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；血清購于美國BI公司；MTS試劑盒購于美國Promega公司；重亞硫酸鹽DNA甲基化試劑盒購于德國Qiagen公司；總RNA提取試劑盒購于美國Omega公司；逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司；引物設(shè)計(jì)及合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 主要儀器與設(shè)備全波長酶標(biāo)儀(型號：Epoch)購于美國Bio Tek公司；流式細(xì)胞儀(型號：CytoFLEX)購于美國BECKMAN公司；倒置相差顯微鏡(型號：ECLIPSE Ts2)購于日本Nicon公司；熱循環(huán)儀(型號：Veriti)、熒光定量PCR儀(型號：7300)購于美國BioSystems公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞用含10%血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞用含10%血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2MTS檢測細(xì)胞增殖活力 取處于對數(shù)生長期的DLD-1、HCT116細(xì)胞，每孔按5×103個(gè)接種至96孔板，每孔體積約100 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；待細(xì)胞密度生長至70%以上，加處理因素；分別設(shè)對照組和PCA處理組，處理組藥物濃度設(shè)為1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L 4個(gè)濃度，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)加入MTS液20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，于酶標(biāo)儀上讀取490 nm吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

1.3.3形態(tài)學(xué)觀察 胰蛋白酶消化并收集DLD-1、HCT116細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；待細(xì)胞貼壁后分別設(shè)對照組和PCA處理組，處理組藥物終濃度為2 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；倒置顯微鏡下觀察DLD-1、HCT116細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡 調(diào)整DLD-1、HCT116細(xì)胞密度至2×105個(gè)/孔接種于6孔板，每孔體積約4 ml，DLD-1、HCT116細(xì)胞PCA終濃度為2 mmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥對照孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞以進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.3.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 無血清培養(yǎng)基重懸DLD-1、HCT116細(xì)胞濃度至2.5×105個(gè)/ml；在24孔板中預(yù)先加入800 μl含10%血清的培養(yǎng)基并放入Transwell小室，1 h后在上室分別接入200 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；取出小室，擦去上層細(xì)胞，PBS清洗后70%冰乙醇固定1 h；0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6BGS檢測Septin9甲基化狀態(tài) 甲基化Septin9上游引物為5’-GGATGAATAGTGGGGAATAGTATTG-3′，下游引物為5′-CAAAAAAAACCCTAAAAAATCACC-3′，擴(kuò)增片段234 bp。根據(jù)制造商的說明書，用細(xì)胞DNA提取試劑盒從DLD-1、HCT116細(xì)胞中提取總DNA，用重亞硫酸鹽DNA甲基化試劑盒進(jìn)行DNA甲基化檢測。

1.3.7qRT-PCR檢測Septin9表達(dá)水平 Septin9上游引物為5′-ACTGCTGCCTCTACTTCA-3′，下游引物為5′-CTGGTGATGTCCTTGATGT-3′，擴(kuò)增片段300 bp。β-actin上游引物為5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-TGGAAGGTGGACAGCGA GG-3′，擴(kuò)增片段550 bp。根據(jù)Omega試劑盒說明書，提取DLD-1、HCT116細(xì)胞總RNA，cDNA逆轉(zhuǎn)錄和目的片段擴(kuò)增按照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行操作，記錄Ct值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 PCA抑制DLD-1、HCT116細(xì)胞增殖MTS檢測結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)上，PCA處理后，DLD-1、HCT116細(xì)胞的抑制率隨著PCA濃度的增加(1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L)呈上升趨勢，高濃度(2.5 mmol/L)對細(xì)胞的增殖抑制最明顯。見圖1A、B。且PCA對DLD-1、HCT116細(xì)胞的生長抑制有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。見表1、2。結(jié)果表明藥物作用的最佳濃度為2.0 mmol/L，最佳時(shí)間為48 h。與此同時(shí)，倒置顯微鏡觀察顯示，DLD-1細(xì)胞生長密度下降，細(xì)胞體積縮小；HCT116細(xì)胞皺縮成團(tuán)，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象并從它們生長的表面回縮。見圖1C。

圖1 PCA抑制DLD-1、HCT116細(xì)胞的增殖

PCA濃度(mmol/L)24 h48 h72 hF/H值P值1.010.80±1.3216.27±1.19▼20.90±1.35▼▲45.978<0.0011.515.63±1.02*22.53±1.59▼30.97±1.46▼▲92.953<0.0012.021.03±2.34*#42.57±5.65▼*#52.13±9.31▼*#18.3930.0032.527.37±3.46*#&44.87±4.35▼*#60.67±7.34▼▲*#29.4620.001F/H值30.12744.72728.099P值<0.001 < 0.001 < 0.001

PCA濃度 (mmol/L)24 h48 h72 hF/H值P值1.08.73±0.8119.00±1.49▼25.90±1.35▼▲142.180<0.0011.514.63±1.12*20.97±1.81▼30.17±1.45▼▲82.689<0.0012.021.97±2.08*#41.53±4.01▼*#55.73±7.28▼▲*#35.2740.0012.528.50±1.75*#&47.83±1.29▼*#&60.90±9.59▼▲*#24.7270.001F/H值95.634108.80225.241P值<0.001<0.001<0.001

2.2 PCA阻滯DLD-1、HCT116細(xì)胞于G2/M期流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，PCA處理后，DLD-1細(xì)胞S期細(xì)胞比例(37.81±3.36)%和G2/M期細(xì)胞比例(26.89±3.98)%高于對照組S期細(xì)胞比例(33.29±4.52)%和G2/M期細(xì)胞比例(17.94±3.00)%；HCT116細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例(43.64±7.53)%高于對照組G2/M期細(xì)胞比例(28.92±4.68)%；兩者處理前后比較，G2/M期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 PCA促進(jìn)DLD-1、HCT116細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，PCA處理后，DLD-1細(xì)胞總凋亡率為(11.15±0.64)%，明顯高于對照組(4.32±0.07)%；HCT116細(xì)胞總凋亡率為(11.93±1.16)%，明顯高于對照組(4.65±1.30)%；兩者處理前后比較，總凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 PCA處理前后DLD-1、HCT116細(xì)胞周期A：DLD-1細(xì)胞；B：HCT116細(xì)胞；與對照組比較：*P<0.05

圖3 PCA處理前后DLD-1、HCT116細(xì)胞凋亡率A：DLD-1細(xì)胞；B：HCT116細(xì)胞；與對照組比較：*P<0.05

2.4 PCA抑制DLD-1、HCT116細(xì)胞遷移結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，PCA處理前后，DLD-1細(xì)胞跨膜數(shù)分別為(34.00±7.55)、(16.60±5.24)個(gè)；HCT116細(xì)胞跨膜數(shù)分別為(34.33±7.77)、(13.53±5.64)個(gè)；兩者處理前后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

2.5 PCA逆轉(zhuǎn)Septin9高甲基化狀態(tài)亞硫酸氫鈉測序結(jié)果顯示，PCA作用于DLD-1、HCT116細(xì)胞后，Septin9啟動子區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化平均水平分別為(45.20±2.48)%、(48.63±1.24)%，均低于對照組(63.50±2.76)%、(68.24±2.34)%，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

2.6 PCA上調(diào)Septin9表達(dá)水平qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，PCA處理后，DLD-1細(xì)胞Septin9 mRNA相對表達(dá)量為(6.43±0.54)，明顯高于對照組(1.00±0.19)；HCT116細(xì)胞Septin9 mRNA相對表達(dá)量為(8.60±1.00)，明顯高于對照組(1.00±0.17)。兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程，涉及一系列經(jīng)典遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)事件的積累。根據(jù)KNUDSON提出經(jīng)典的腫瘤發(fā)生的“二次打擊理論”，表觀遺傳異常改變在結(jié)腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮著更重要的作用。Septin9是抑癌基因家族成員之一，其高甲基化會導(dǎo)致自身表達(dá)異常，從而失去正常的抑癌作用。研究[9]表明Septin9基因高甲基化及轉(zhuǎn)錄缺失見于多種腫瘤。

圖4 PCA處理前后DLD-1、HCT116細(xì)胞遷移 × 200 A：DLD-1細(xì)胞；B：HCT116細(xì)胞；與對照組比較：*P<0.05

圖5 PCA處理前后DLD-1、HCT116細(xì)胞Septin9甲基化狀態(tài)

圖6 PCA處理前后DLD-1、HCT116細(xì)胞Septin9 mRNA表達(dá)量

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上。由于DNA甲基化不同于經(jīng)典遺傳學(xué)改變，具有可逆性的特點(diǎn)，因此可以應(yīng)用DNMTs抑制劑逆轉(zhuǎn)DNA甲基化，使得抑癌基因重新被激活，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用，這對于腫瘤治療來說是十分有意義的[10]。PCA是臨床常用的局部麻醉藥物，也是常見的非核苷類DNMTs抑制劑之一，能夠逆轉(zhuǎn)多種實(shí)體腫瘤的惡性生物學(xué)行為。Xuan et al[7]研究發(fā)現(xiàn)PCA對人乳腺癌細(xì)胞具有生長抑制作用，其對乳腺癌細(xì)胞DNA甲基化的抑制作用是通過抑癌基因的活化發(fā)揮的。Li et al[8]在對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PCA可以通過上調(diào)抑癌基因CDKN2A和RARβ的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖并且促進(jìn)其凋亡。方潔 等[11]通過對人膀胱癌T24細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PCA可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期。Ying et al[12]通過研究發(fā)現(xiàn)PCA能抑制人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)通過上調(diào)腫瘤抑制基因MiR-133b促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。在非小細(xì)胞肺癌A549、NCI-H1975細(xì)胞株和其他的一些腫瘤模型中，PCA也表現(xiàn)出了潛在的治療作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCA抑制結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細(xì)胞的增殖和遷移能力，并且對其生長抑制有濃度依賴和時(shí)間依賴效應(yīng)；PCA能顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細(xì)胞凋亡，并且主要將細(xì)胞阻滯在G2/M期。未經(jīng)PCA處理的結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細(xì)胞，其Septin9基因 5’端啟動子區(qū)域CpG島出現(xiàn)不同程度的甲基化，而使用去甲基化藥物PCA處理后，Septin9基因的甲基化程度明顯下降。進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測Septin9基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，PCA處理后Septin9 mRNA的表達(dá)量明顯增加。以上結(jié)果表明，PCA能夠通過逆轉(zhuǎn)Septin9甲基化，上調(diào)其表達(dá)水平，從而抑制結(jié)腸癌DLD-1、HCT116細(xì)胞的增殖。

目前已報(bào)道的DNMTs抑制劑主要分為核苷類抑制劑和非核苷類抑制劑。地西他濱在幾種核苷類抑制劑中具有最強(qiáng)的去甲基化作用，并且被用于初治及難治復(fù)發(fā)MDS等惡性血液病患者的治療[14]，但由于常導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)和表現(xiàn)出骨髓毒性而限制了其廣泛的臨床應(yīng)用[15]?？赡苁怯捎诤塑疹愐种苿┩ㄟ^在DNA復(fù)制過程中摻入新合成的DNA分子發(fā)揮作用。而非核苷類抑制劑PCA由于其毒副作用小、價(jià)格便宜、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景，未來有望成為基于表觀遺傳學(xué)結(jié)腸癌治療的安全候選藥物。