HOTAIR在急性髓細(xì)胞性白血病中的表達(dá)及其對(duì)柔紅霉素耐藥的作用機(jī)制

陳玲琳，熊術(shù)道，高申孟

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一組由染色體易位和(或)體細(xì)胞突變等多種遺傳異常引起的造血系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，LncRNAs)是非編碼RNA的一種，是轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNAs[2]。HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的LncRNAs基因[3]。研究表明，HOTAIR表達(dá)水平上調(diào)不但與多種腫瘤包括乳腺癌[4]、宮頸癌[5]、AML[6]等的發(fā)生相關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞的耐藥密切相關(guān)[7]。與柔紅霉素(daunorubicin,DNR)聯(lián)合用藥是AML化療的重要方案，研究[8]表明臨床上DNR耐藥情況遞增。因此，了解AML對(duì)DNR耐藥機(jī)制有助于改善疾病的治療。而有關(guān)HOTAIR與AML耐藥的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。該研究選取U937和TPH1耐藥細(xì)胞株為研究對(duì)象，以shRNA作為病毒載體下調(diào)細(xì)胞中的HOTAIR表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)AML細(xì)胞對(duì)DNR的耐藥，探討相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑AML細(xì)胞株(HL60、THP1、U937、KG1、Kasumi-1、NB4、HEL、Kasumi-3、U937、THP1)及293T細(xì)胞株為溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保種。AML患者來(lái)源的骨髓單個(gè)核細(xì)胞50例(AML原代細(xì)胞)、正常捐獻(xiàn)者骨髓單個(gè)核細(xì)胞10例均來(lái)源于2017年5月～2018年10月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，標(biāo)本采集前通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。分型標(biāo)準(zhǔn)參照French-America-British(FAB)標(biāo)準(zhǔn)，明確診斷為AML。RPMI 1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、青霉素鏈霉素溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCR引物購(gòu)自上海尼桑生物科技有限公司；Actin抗體與P-糖蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；qRT-PCR儀、RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；DNR購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；流式AnnexinV/PI試劑購(gòu)自美國(guó)Becton-Dickinson公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；optiMEN、X-gene 9 購(gòu)自瑞士羅氏公司；sh-NC載體、sh-HOTAIR載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)293T細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基；U937細(xì)胞、THP1細(xì)胞使用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基；37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每48 h換液、傳代1次。

1.3 病毒包被取470 μl optiMEN、30 μl X-gene 9、sh-NC載體、sh-HOTAIR載體以及輔助質(zhì)粒Gap-pol和VSVG,共同轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后棄上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)液。收集培養(yǎng)后48、72 h上清液。兩次上清液以2 000 r/min離心10 min，0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，-80 ℃保存待用。

1.4 載體轉(zhuǎn)染U937與THP1細(xì)胞以5×105/ml濃度，0.5 ml鋪6孔板，分別加入 sh-NC、sh-HOTAIR病毒上清液3 ml，1 500 r/min離心2 h,37 ℃、5% CO2孵育48 h后，加入嘌呤霉素篩選7 d。

1.5 Western blot檢測(cè)P-糖蛋白載體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)取等量活細(xì)胞，離心棄上清加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提蛋白，用BAC試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加5×蛋白上樣緩沖液混勻變性。10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)140 V×40 min，電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜220 mA×1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗后各自孵育P-糖蛋白(1 ∶2 000)與Actin(1 ∶5 000)抗體4 ℃過(guò)夜。棄一抗，TBST清洗3次，室溫孵相應(yīng)HRP-標(biāo)記的相應(yīng)二抗1 h，TBST清洗3次，加ECL試劑并上機(jī)顯影。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR的表達(dá)標(biāo)本用TRIzol提取總RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA，以GAPDH(上游引物：5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，下游引物：5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’)為內(nèi)參，40個(gè)循環(huán)qRT-PCR對(duì)其中的HOTAIR(上游引物：5’-AAAAGAGAGGGGTGGGAAGG-3’，下游引物：5’-CCGGAAATCAGGGCAGAATG-3’)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，上述引物由上海尼桑生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。計(jì)算2-ΔΔCt值分析結(jié)果。

1.7 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種于96孔板,密度為104個(gè)/孔，體積為100 μl。每孔的DNR終濃度為0.1 μmol/L,重復(fù)3孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μl CCK-8試劑，避光孵育2 h，450 nm檢測(cè)各組吸光度。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板中，加DNR終濃度為0.1 μmol/L為實(shí)驗(yàn)組,不加藥組對(duì)照組，每株細(xì)胞重復(fù)3孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，加試劑避光孵育后檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在AML標(biāo)本及細(xì)胞株中表達(dá)選取AML細(xì)胞系、AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞、正常捐獻(xiàn)者骨髓。提RNA，逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組(10.70±2.85)比較，AML細(xì)胞系HOTAIR(30.50±8.39)表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組(10.77±3.20)比較，AML原代細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)(43.60±6.39)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1 HOTAIR在不同細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 DNR對(duì)AML細(xì)胞增殖影響終濃度為0.1 μmol/L的DNR處理24 h后,sh-HOTAIR+THP1組比sh-NC+THP1組增殖顯著下降(t=37.25，P<0.001)，sh-HOTAIR+U937組比sh-NC+U937組增殖顯著下降(t=29.47，P<0.001)(圖2)，提示在相同的藥物濃度下，sh-HOTAIR組增殖低，HOTAIR表達(dá)與藥物敏感相關(guān)。

圖2 DNR對(duì)不同細(xì)胞增殖的影響

圖3 沉默HOTAIR促進(jìn)DNR對(duì)AML細(xì)胞凋亡

2.3 DNR對(duì)AML細(xì)胞凋亡影響轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞分兩組，不加藥為對(duì)照組，另一組加終濃度0.1 μmol/L DNR組。 THP1細(xì)胞，DNR+sh-NC組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照sh-NC組(t=18.77,P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照sh-HOTAIR組(t=30.77，P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細(xì)胞凋亡率高于DNR+sh-NC組(t=10.75，P<0.05)；U937細(xì)胞，DNR+sh-NC組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照 sh-NC組(t=28.60，P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照sh-HOTAIR組(t=40.49，P<0.001)，DNR+sh-HOTAIR組細(xì)胞凋亡率高于DNR+sh-NC組(t=15.33，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 干擾HOTAIR影響P-糖蛋白的表達(dá)HOTAIR在AML中表達(dá)上調(diào)，為研究其是否參與耐藥，本研究進(jìn)一步沉默HOTAIR的表達(dá)(圖4)，與sh-NC+THP1組(56.30±0.15)比較，sh-HOTAIR+THP1組(23.88±0.34)HOTAIR表達(dá)顯著下調(diào)；與sh-NC+U937組(49.99±0.76)比較，sh-HOTAIR+U937組(25.81±0.25)HOTAIR表達(dá)顯著下調(diào)；觀察HOTAIR對(duì)耐藥蛋白P-糖蛋白表達(dá)的影響，Western blot結(jié)果表明，THP1細(xì)胞，與sh-NC組比較，sh-HOTAIR組P-糖蛋白表達(dá)明顯下降(t=87.21，P<0.001)；U937細(xì)胞，與sh-NC組比較，sh-HOTAIR組P-糖蛋白表達(dá)明顯下降(t=81.39，P<0.001)。提示P-糖蛋白表達(dá)與HOTAIR表達(dá)水平相關(guān)(圖5)。

3 討論

AML是常見(jiàn)的血液系統(tǒng)腫瘤，除了早幼粒細(xì)胞白血病(M3)外，其他類(lèi)型的AML目前仍無(wú)法治愈[9]，其中復(fù)發(fā)、耐藥是AML重要死亡原因之一。DNR是AML化療方案中的重要藥物，然而，關(guān)于AML對(duì)DNR的耐藥機(jī)制，尚未完全闡明。本研究顯示HOTAIR在AML細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)，沉默HOTAIR表達(dá)及聯(lián)合DNR不僅有利于抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且可明顯下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)。表明HOTAIR可能參與了AML的發(fā)生發(fā)展及耐藥形成。本研究結(jié)果可能為AML的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及藥物靶向治療提供新的研究基礎(chǔ)及思路。

研究表明 HOTAIR在AML中異常表達(dá)且與腫瘤耐藥相關(guān)。本研究對(duì)原代AML細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞株的研究顯示HOTAIR在AML細(xì)胞表達(dá)明顯上調(diào)，與Wu et al[10]研究相似。

HOTAIR參與腫瘤耐藥研究得到越來(lái)越多的關(guān)注。Cheng et al[11]研究表明沉默HOTAIR胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的半數(shù)抑制濃度顯著下降。Yang et al[12]研究表明HOTAIR在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)細(xì)胞對(duì)克唑替尼的耐藥。抑制HOTAIR的表達(dá)促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感[7]，上述研究表明HOTAIR可能對(duì)細(xì)胞耐藥起著關(guān)鍵作用。本研究顯示，在終濃度為0.1 μmol/L的DNR作用下，敲低HOTAIR表達(dá)，可以抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。表明敲低LncRNAs HOTAIR可有效提高THP1與U937細(xì)胞對(duì)DNR的藥物敏感性，提示HOTAIR可能參與了AML耐藥。

人P-糖蛋白存在于正常組織胃腸道、肝臟和腎臟上皮細(xì)胞以及大腦的毛細(xì)血管、睪丸和卵巢中，P-糖蛋白充當(dāng)了大腦、睪丸和卵巢的屏障，促進(jìn)各器官排泄功能。P-糖蛋白由耐藥基因MDR1編碼，定位于細(xì)胞膜上，是ATP結(jié)合盒式(ATP bindingcassette，ABC)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員，通過(guò)ATP釋放能量將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，降低胞內(nèi)的藥物濃度[13]。Kong et al[14]研究表明，上調(diào)肝癌細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)，細(xì)胞的P-糖蛋白表達(dá)上升，誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對(duì)藥物耐藥。本研究結(jié)果表明，沉默THP1與U937細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)，細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)也相應(yīng)下降；P-糖蛋白對(duì)DNR外排作用降低，致使細(xì)胞增殖下降。同樣，在終濃度為0.1 μmol/L的DNR作用下，敲低HOTAIR的表達(dá)，P-糖蛋白表達(dá)下降，DNR被泵出細(xì)胞的量減少，滯留細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)白血病細(xì)胞的作用增強(qiáng)，可以促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡[15]。因此，下調(diào)HOTAIR表達(dá)并協(xié)同DNR作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究表明HOTAIR在AML中表達(dá)上調(diào)，抑制HOTAIR表達(dá)，可以下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)，促進(jìn)AML耐藥細(xì)胞株對(duì)DNR的敏感性，進(jìn)而抑制AML細(xì)胞增殖，促進(jìn)其發(fā)生凋亡。HOTAIR表達(dá)異常，參與了AML對(duì)DNR耐藥作用及其機(jī)制，研究結(jié)果為AML對(duì)DNR耐藥干預(yù)提供了新的潛在靶點(diǎn)。