格列齊特調(diào)節(jié)InsR/PI3K/GSK-3β通路改善2型糖尿病小鼠肝臟胰島素抵抗作用

趙天嬌，黃 瓊，魏 偉

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要特征為胰島素分泌不足或胰島素抵抗[1]。胰島素抵抗會導(dǎo)致肝臟、肌肉和脂肪組織對一定量的胰島素產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平，造成葡萄糖攝取和糖原合成受損等[2-3]。

胰島素抵抗與胰島素信號通路的密切相關(guān)，其中任何一個環(huán)節(jié)缺陷均可引起抵抗，如胰島素受體(insulin receptor，InsR)、胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS1)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)等蛋白缺陷均可導(dǎo)致胰島素信號通路的失調(diào)[4-6]。

格列齊特是一種磺脲類降糖藥[8]，通過特異性的關(guān)閉胰島β細(xì)胞膜上KATP通道促胰島素分泌[8]，也可通過增加InsR磷酸化改善C2C12肌肉細(xì)胞胰島素抵抗[9]；促進(jìn)GLUT4膜轉(zhuǎn)移改善過氧化氫誘導(dǎo)的3T3L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗[10]。但是，格列齊特改善肝臟胰島素抵抗的機制尚未完全闡明[8-11]。該研究旨在探討格列齊特改善T2DM肝臟胰島素抵抗的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)、胰島素、格列齊特(美國Sigma公司)；InsR抗體(美國Proteintech公司，貨號：20433-1-AP，濃度：1 ∶1 000)、PI3K抗體(美國Proteintech公司，貨號：4G3C11, 濃度：1 ∶1 000)、GSK3β抗體(美國Proteintech公司，貨號：22104-1-AP，濃度：1 ∶1 000)、β-Actin抗體(美國Proteintech公司，貨號：66009-1-lg，濃度：1 ∶1 000)；IRS1抗體(美國Affinity Bioscience公司, 貨號: AF3272濃度：1 ∶500)、GLUT4抗體(美國Affinity Bioscience公司，貨號：AF5386, 濃度：1 ∶500)；p-IRS1抗體(美國Abcam公司，貨號：ab131487，濃度：1 ∶500)、p-GSK3β抗體(美國Abcam公司，貨號：ab75745，濃度：1 ∶500)；葡萄糖試劑盒(南京建成公司)；糖原試劑盒(北京索萊寶公司)；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG二抗、辣氧過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋)。

1.1.3實驗細(xì)胞株 HepG2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1T2DM動物模型的制備 C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分出8只作為正常組。其余小鼠喂以4周高脂飼料，自由進(jìn)水；第5周末，連續(xù)3 d腹腔注射STZ(60 mg/kg)誘導(dǎo)T2DM模型。72 h后剪尾采血測量空腹血糖，以禁食12 h血糖≥11.1 mmol/L認(rèn)為是成功[12]，并隨機分為T2DM組、格列齊特低劑量組(5 mg/kg)、中劑量組(10 mg/kg)、高劑量組(20 mg/kg)，每組8只。格列齊特每日灌胃給藥一次，共4周；正常組和T2DM組生理鹽水灌胃。

1.2.2HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立與分組 HepG2細(xì)胞株用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[13]的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，將HepG2細(xì)胞以1×104個/孔(100 μl)種于96孔培養(yǎng)板，80%融合后，對照組加正常培養(yǎng)液，胰島素刺激組加1 μmol/L胰島素的培養(yǎng)液，分別刺激24、36、48 h。孵育結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，換上含2%血清的無酚紅培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，用葡萄糖測定試劑盒測定培養(yǎng)液上清中的葡萄糖含量。葡萄糖消耗量=空白孔中葡萄糖含量-測定孔中葡萄糖含量。確定最佳作用時間。

確定胰島素最佳時間后，用10、1 μmol/L，100、10 nmol/L胰島素的培養(yǎng)液選擇胰島素最佳濃度。胰島素抵抗細(xì)胞模型建立后，設(shè)置對照組、胰島素刺激組、格列齊特組(2.5、5、10 mmol/L)。

1.2.3葡萄糖代謝指標(biāo)的測定 給藥期間每周測定小鼠空腹血糖1次。檢測前小鼠禁食不禁水10 h，尾尖取血。給藥前，正常組和T2DM組小鼠進(jìn)行腹腔注射糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)；給藥結(jié)束后，各組均行IPGTT。小鼠禁食不禁水10 h后，腹腔注射1g/kg葡萄糖；于注射后0、15、30、60、120 min尾尖血測血糖，計算血糖-時間曲線下面積(area under the curve，AUC)。

1.2.4血清生化指標(biāo)的測定 給藥結(jié)束后，動物禁食12 h后眼眶取血，分離血清，ELISA法檢測血清中胰島素水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=(空腹血糖)×(空腹血清胰島素)/22.5。

目前，有許多類型的在中國的混凝土攪拌機，但按照混合攪拌機的結(jié)構(gòu)，不同材料的混合，混合機的要求是不一樣的，攪拌質(zhì)量好，結(jié)構(gòu)設(shè)計合理，使用方便，地基穩(wěn)定性，根據(jù)這些要求和混凝土攪拌機的要求進(jìn)行設(shè)計。

1.2.5肝臟組織的處理與收集 頸部脫臼處死小鼠，迅速取出肝組織，用生理鹽水洗凈后，固定于4%多聚甲醛或保存于-80 ℃。

1.2.6胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和糖原含量的測定 葡萄糖氧化酶法檢測細(xì)胞葡萄糖消耗的變化。糖原測定試劑盒檢測糖原含量，將HepG2細(xì)胞以1×104個/孔(100 μl)種于24孔培養(yǎng)板，1 μmol/L胰島素處理48 h，SpectraMax M5分光光度計測定吸光度(620 nm)[14]。

1.2.7Western blot法 裂解液提蛋白，InsR、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-GSK3β/GSK3β、GLUT4抗體檢測蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 格列齊特改善T2DM小鼠空腹血糖4周高脂聯(lián)合3次小劑量腹腔注射STZ誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠空腹血糖值均≥11.1 mmol/L，造模成功。格列齊特低、中、高劑量組給藥4周后均降低T2DM小鼠的空腹血糖水平(F=114.9，P<0.01)，提示格列齊特具有降血糖作用 (圖1、表1、2)。

圖1 格列齊特對T2DM小鼠空腹血糖的影響(n=8)

表1 格列齊特給藥0和4周T2DM小鼠空腹血糖水平

表2 格列齊特給藥4周T2DM小鼠空腹血糖水平

2.2 格列齊特改善T2DM小鼠葡萄糖耐量給藥前，T2DM組小鼠腹腔注射葡萄糖后2 h內(nèi)的血糖水平一直居高不下，且2 h后無法恢復(fù)到初始水平；T2DM組小鼠AUC較正常組升高(F=185.052，P<0.01)(圖2)，提示T2DM組小鼠糖耐量異常。

給藥結(jié)束后，T2DM組小鼠空腹血糖及腹腔注射葡萄糖后2 h內(nèi)的血糖水平較同期正常組升高，且2 h后血糖無法恢復(fù)到初始水平，提示其葡萄糖耐量異常；格列齊特治療組小鼠血糖水平較同期T2DM組均降低，2 h后血糖恢復(fù)到初始水平。 T2DM小鼠AUC較正常對照組升高，格列齊特治療組AUC較T2DM組小鼠降低，提示格列齊特低、中、高劑量組均可改善T2DM小鼠糖耐量異常(F=26.185，P<0.01)(圖2)。

2.3 格列齊特對T2DM小鼠血清胰島素和胰島素敏感性的影響與正常組比較，T2DM組小鼠血清胰島素水平降低，格列齊特治療組小鼠血清胰島素水平較T2DM組小鼠升高，提示格列齊特可以促進(jìn)胰島素分泌(F=24.443，P<0.01)(圖3A)。T2DM組小鼠HOMA-IR較正常組升高，格列齊特治療組HOMA-IR較T2DM組降低(F=21.252，P<0.05)，提示格列齊特可以改善T2DM小鼠胰島素抵抗(圖3B)。

2.4 格列齊特保護(hù)T2DM胰島素抵抗小鼠肝損傷肝臟HE染色表明，正常組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，邊界清晰；T2DM小鼠肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，伴有脂質(zhì)空泡，核質(zhì)破裂，結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的壞死；格列齊特各劑量組均可以改善肝臟的理變化，減少脂質(zhì)空泡和肝細(xì)胞壞死，使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，且格列齊特10 mg/kg和格列齊特20 mg/kg較格列齊特5 mg/kg保護(hù)作用好。表明格列齊特可以保護(hù)T2DM小鼠肝臟損傷(圖4)。

2.5 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的最佳濃度和作用時間胰島素作用24、36、48、60 h均可造成HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量下降(F=4.562，P<0.05)，48 h葡萄糖消耗量最小，因此確定胰島素最佳作用時間為48 h(圖5A)。100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L濃度的胰島素刺激48 h后(F=3.192，P<0.01)，HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量下降，且1 μmol/L胰島素刺激組的葡萄糖消耗量最小，故將此濃度作為胰島素最佳濃度(圖5B)。

2.6 格列齊特改善胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和糖原含量與對照組比較，胰島素刺激組葡萄糖消耗量下降；與胰島素組比較，格列齊特組葡萄糖消耗增加(F=13.111，P<0.01)(圖6A)。胰島素刺激組糖原含量較對照組減少，格列齊特各濃度組較模型組糖原含量增多，提示格列齊特可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和糖原含量，10 mmol/L效果最佳(F=38.968，P<0.05)(圖6B)。

2.7 格列齊特上調(diào)T2DM小鼠和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的胰島素信號通路格列齊特可以增加T2DM小鼠肝組織和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞InsR(FInsR,肝=91.093,P<0.01;FInsR,HepG2=76.479,P<0.01)和PI3K(FPI3K,肝=96.319，P<0.01；FPI3K,HepG2=93.645,P<0.01)的表達(dá)，促進(jìn)IRS1磷酸化(Fp-IRS1,肝=21.835，P<0.01；Fp-IRS1,HepG2=38.230，P<0.01)，抑制p-GSK3β磷酸化(Fp-GSK3β,肝=41.575,P<0.01;Fp-GSK3β,HepG2=103.452，P<0.01)(圖7、8)。此外，格列齊特可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞GLUT4的膜表達(dá)(F=114.411，P<0.01)(圖9)。

3 討論

胰島素抵抗是糖尿病、高血壓和肥胖等疾病的共同發(fā)病機制之一。目前臨床上用于治療糖尿病的藥物中，具有改善胰島素抵抗的藥物主要包括雙胍類和噻唑烷二酮類。但這兩類藥物由于胃腸道不耐受或繼發(fā)不良反應(yīng)等原因，導(dǎo)致部分患者服用后胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)無法改善，甚至導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥提早出現(xiàn)[15]，故尋找更多的能夠改善胰島素抵抗的藥物很有必要。格列齊特通過選擇性作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島素分泌的作用以降低血糖，但格列齊特對T2DM肝臟胰島素抵抗的作用尚不清楚[8]。本研究擬通過構(gòu)建T2DM小鼠模型和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型來探究格列齊特對肝臟胰島素抵抗的作用及其可能的分子機制。

T2DM小鼠模型的給藥結(jié)果顯示，格列齊特可以降低T2DM小鼠空腹血糖，改善糖耐量，增強機體對血糖的調(diào)節(jié)能力；促進(jìn)胰島素分泌，改善T2DM小鼠對胰島素敏感性。同時格列齊特可以改善T2DM小鼠的肝臟損傷，肝臟空泡化和肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加完整，排列整齊，核質(zhì)清晰，邊界清楚。此外，格列齊特還可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗和糖原含量。這提示格列齊特能夠改善T2DM小鼠肝臟胰島素抵抗，促進(jìn)葡萄糖代謝和糖原合成。

圖8 格列齊特調(diào)節(jié)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞胰島素信號通路(n=3)

圖9 格列齊特對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞GLUT4膜表達(dá)的影響(n=3)

前期研究發(fā)現(xiàn)，格列齊特可能通過促進(jìn)InsR磷酸化提高胰島素抵抗C2C12細(xì)胞的胰島素敏感性；通過促進(jìn)GLUT4膜易位改善過氧化氫誘導(dǎo)的胰島素抵抗3T3L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，這提示格列齊特可能通過恢復(fù)胰島素信號通路的傳導(dǎo)改善體內(nèi)各組織胰島素抵抗的水平[9-10]。但格列齊特對肝臟胰島素信號通路的調(diào)控作用尚不清楚，故為了進(jìn)一步探究格列齊特改善肝臟胰島素抵抗的作用機制，我們檢測了格列齊特對T2DM小鼠肝組織和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中胰島素信號通路相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果表明，格列齊特可以增加T2DM小鼠肝臟和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞InsR和PI3K表達(dá)，促進(jìn)IRS1磷酸化，抑制GSK3β磷酸化。同時，格列齊特還可以增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞GLUT4膜表達(dá)。因此，格列齊特改善肝臟胰島素抵抗的分子機制可能與上調(diào)胰島素信號通路有關(guān)。

在本研究當(dāng)中我們用高脂喂養(yǎng)C57BL/6小鼠4周后腹腔注射STZ誘導(dǎo)T2DM動物模型，該模型造模成功率高，重復(fù)性好，且成本較低，能夠很好的滿足我們對實驗的要求。但該模型仍存在造模時間長，只能模仿糖尿病的某一方面或某些方面特點的局限性，故我們下一步將采用db/db小鼠觀察格列齊特的治療作用。此外，在本研究中，我們只探討了格列齊特對胰島素信號通路InsR、IRS1和PI3K的影響，胰島素信號通路中其他關(guān)鍵組分有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，格列齊特可以顯著改善T2DM小鼠肝臟胰島素抵抗的糖代謝和肝損傷，增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗和糖原合成，其機制可能與上調(diào)胰島素信號通路有關(guān)。