鐵代謝異常在新生隱球菌腦膜炎感染中的相關(guān)研究

徐 濤，林文婷，王曉莉，陳江漢

隱球菌性腦膜炎是一類(lèi)侵襲性真菌感染，致病菌主要為新生隱球菌和格特隱球菌，傳播媒介多為環(huán)境中的鴿糞，防治困難，后遺癥多，且患者死亡風(fēng)險(xiǎn)高[1-3]。隱球菌感染在免疫缺陷人群如艾滋?。ˋIDS）、器官移植患者中高發(fā)，但在臨床中?？捎^(guān)察到無(wú)特定免疫缺陷人群的發(fā)病[4,5]。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)血清抗粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）抗體所致的免疫功能障礙可以部分解釋格特隱球菌感染這類(lèi)“免疫正?！比巳旱脑騕6,7]。但新生隱球菌感染的相關(guān)機(jī)制仍不清楚。鐵是隱球菌的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中鐵濃度的不同直接影響隱球菌莢膜的大小[8]。隱球菌感染后宿主會(huì)通過(guò)一系列調(diào)節(jié)機(jī)制加快細(xì)胞對(duì)鐵離子的攝取，血清鐵濃度顯著下降而鐵蛋白濃度上升，從而達(dá)到與隱球菌競(jìng)爭(zhēng)鐵的效果[9]。筆者設(shè)想鐵代謝與調(diào)節(jié)障礙可能與隱球菌感染有關(guān)。本研究共采集10 例無(wú)特定免疫缺陷的隱球菌性腦膜炎患者和10 名健康志愿者的血液樣本，通過(guò)血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測(cè)，探究新生隱球菌感染該人群的可能原因。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性篩選2016 年1 月—2018 年6 月在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科住院并確診為隱球菌性腦膜炎的患者，通過(guò)外周血免疫球蛋白、淋巴細(xì)胞檢測(cè)和詢(xún)問(wèn)病史排除人免疫缺陷病毒（HIV）感染、惡性腫瘤、器官移植或長(zhǎng)期使用免疫抑制藥物等常見(jiàn)免疫缺陷因素?；颊呓M年齡26 ～62 歲，女4 例，男6 例；對(duì)照組為健康志愿者10 名，年齡24 ～55 歲，女4 例，男6 例。納入的研究對(duì)象均簽訂知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院臨床科學(xué)研究倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 隱球菌菌株篩選與標(biāo)本采集 常規(guī)收集住院隱球菌性腦膜炎患者的腦脊液樣本，通過(guò)YPD 培養(yǎng)基培養(yǎng)隱球菌，CGB 培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定。從中篩選出感染菌株為新生隱球菌的患者，并采集血液樣本?；颊咧斡鲈? 個(gè)月后，于復(fù)查時(shí)采集治療后血液樣本。受試者均在清晨空腹時(shí)于肘靜脈處采集外周全血5 ml，置于無(wú)抗凝劑試管中靜置待凝固，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 分min，收集上清貯存在-80 ℃中待檢。

1.2.2 血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體濃度測(cè)定 鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測(cè)均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），人ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司，具體操作按照說(shuō)明書(shū)完成。使用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在450 nm 處吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣本中的目標(biāo)蛋白含量。血清鐵檢測(cè)采用亞鐵嗪微板法，鐵檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，具體操作按照說(shuō)明書(shū)完成。使用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在562 nm 處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度計(jì)算樣本中鐵濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，連續(xù)性變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）描述，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組之間差異比較采用方差分析，如方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體濃度比較

患者組治療前后鐵蛋白水平分別為（1 119.70±458.11）μg/L、（212.88±137.15）μg/L， 對(duì) 照 組 為（105.71±47.51）μg/L（鐵蛋白正常值：男15 ～200 μg/L，女12 ～150 μg/L），兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（治療前:治療后P＜0.001；治療后：對(duì)照組P=0.039；治療前：對(duì)照組P＜0.001，比較順序下文同）。治療前后可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平分別為（91.31±66.65）nmol/L、（86.02±52.42）nmol/L，對(duì) 照 組為（34.44±10.20）nmol/L（可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體正常值：20.8 ～59.16 nmol/L），治療前后與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025，P=0.013），但治療前后相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.846）。治療前后血清鐵水平（19.72±11.65）μmol/L、（25.75±16.60）μmol/L，與對(duì)照組（18.97±6.39）μmol/L 兩兩相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.359，P=0.252，P=0.861）（血清鐵正常值：男11.6 ～31.3 μmol/L，女9 ～30.4 μmol/L）。治療前后轉(zhuǎn)鐵蛋白水平（2.46±0.50）g/L、（2.32±0.48）g/L，對(duì)照組（2.73±0.38）g/L（轉(zhuǎn)鐵蛋白正常值：2.2 ～4.0 g/L），兩兩相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.547，P=0.051，P=0.183）。

2.2 鐵代謝異常患者與對(duì)照組血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體濃度比較

在上一步統(tǒng)計(jì)分析中發(fā)現(xiàn)，患者組治療前血清鐵水平未見(jiàn)降低，不符合隱球菌感染常規(guī)表現(xiàn)，且治療前后可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平均較高，懷疑部分患者存在鐵代謝異常。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐個(gè)篩查后，發(fā)現(xiàn)異常值主要來(lái)源于4 例患者，其治療前后血清鐵、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與對(duì)照組相比有顯著差異（圖1），一旦排除這4 例患者，其余患者治療前后血清鐵、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖2）。隨后查閱這4 例患者住院時(shí)臨床資料發(fā)現(xiàn)，血常規(guī)結(jié)果均提示小細(xì)胞低色素性貧血（表1）。

圖1 鐵代謝異常4例患者血清各指標(biāo)與對(duì)照組比較

3 討論

鐵離子在人體代謝中發(fā)揮多種重要作用，但它也是病原菌生長(zhǎng)不可或缺的微量元素。隱球菌重要毒力因子黑色素的形成依賴(lài)于鐵的攝取，而莢膜體積與環(huán)境中鐵離子濃度密切相關(guān)[10,11]。因?yàn)轶w液中鐵離子含量較低，隱球菌通過(guò)一系列轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有效攝取宿主體內(nèi)鐵元素。包括亞鐵氧化酶Cfos（Cfo1、Cfo2）[12]，細(xì)胞膜上的鐵離子還原酶Fre 家族，其中Fre2 可從宿主血紅蛋白和血紅素內(nèi)攝取鐵元素[13]；以及借助鐵透過(guò)酶Cfts（Cft1、Cft2），研究發(fā)現(xiàn)Cft1 與鐵離子有較高親和力，從而可以競(jìng)爭(zhēng)利用轉(zhuǎn)鐵蛋白中的鐵元素，Cft1 敲除菌株利用轉(zhuǎn)鐵蛋白的能力與生長(zhǎng)速度明顯下降[14,15]。在宿主體內(nèi)隱球菌通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平，以及細(xì)胞器內(nèi)的鐵結(jié)合蛋白如Grx4 水平，維持自身鐵代謝平衡，并滿(mǎn)足自身生長(zhǎng)需求[17,18]。

因?yàn)殡[球菌對(duì)鐵元素的競(jìng)爭(zhēng)利用，機(jī)體會(huì)通過(guò)一系列調(diào)控干擾其生長(zhǎng)發(fā)育。正常情況下轉(zhuǎn)鐵蛋白與鐵離子結(jié)合后通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，并參與血紅蛋白的形成。隱球菌感染后免疫細(xì)胞會(huì)大量吞噬紅細(xì)胞，攝取其內(nèi)部的鐵離子，同時(shí)鐵蛋白合成增多，加速鐵元素從功能狀態(tài)向儲(chǔ)存狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，使得血清鐵水平下降而鐵蛋白水平上升，減少隱球菌可利用鐵的來(lái)源[19]。該研究中4 例鐵代謝異?；颊邉t存在調(diào)節(jié)障礙，其治療前后血清鐵、鐵蛋白水平均較高，提示患者體內(nèi)儲(chǔ)鐵量并不低但血常規(guī)卻提示小細(xì)胞低色素性貧血。因此在鐵代謝進(jìn)程中存在部分環(huán)節(jié)的異常，可能為紅細(xì)胞攝取鐵異常，或由于血紅素合成障礙引起的紅細(xì)胞內(nèi)鐵利用不良。機(jī)體與隱球菌競(jìng)爭(zhēng)鐵能力的不足或?qū)е略擃?lèi)患者易受其侵襲性感染的可能原因[20]：①鐵在組織、血液中的大量富集為隱球菌提供了充足的鐵源；②感染發(fā)生后，機(jī)體不能將鐵快速轉(zhuǎn)移；③貧血本身削弱了患者免疫功能；④充足的鐵源有利于隱球菌莢膜體積和毒力因子上升，提升了侵襲性與致病力[21]。因此，該類(lèi)患者鐵代謝異常可能與隱球菌感染有潛在關(guān)聯(lián)。

本研究存在一定的局限性。首先，納入患者數(shù)量有限，本次研究?jī)H選取新生隱球菌感染患者；其次，并非全部患者均表現(xiàn)出鐵代謝異常，因此不能完全說(shuō)明其與新生隱球菌感染相關(guān)。最后，前期標(biāo)本留取僅為血液樣本，實(shí)驗(yàn)手段有限，因此僅采用ELISA 法檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。在后續(xù)臨床診治中筆者將進(jìn)一步篩查是否有更多患者存在類(lèi)似鐵代謝障礙，同時(shí)擴(kuò)大樣本含量，通過(guò)流行病學(xué)研究探尋鐵代謝障礙是否為隱球菌感染的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)部分無(wú)特殊免疫缺陷的新生隱球菌感染患者存在鐵代謝異常，高血清鐵水平可能對(duì)隱球菌感染有潛在影響。未來(lái)在對(duì)類(lèi)似患者診治中，需密切關(guān)注鐵代謝指標(biāo)，對(duì)于相關(guān)疾病做到早診斷、早治療，或可改善預(yù)后，減少類(lèi)似機(jī)會(huì)性感染的復(fù)發(fā)。

圖2 其余患者血清各指標(biāo)與對(duì)照組比較

表1 4例鐵代謝異常患者血常規(guī)貧血相關(guān)指標(biāo)