好食脈孢霉纖溶酶的純化及體外纖溶活性研究

鄧永平，車 鑫，艾瑞波，劉曉蘭*，郭建華

1齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院；2黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，齊齊哈爾 161006

血栓栓塞性疾病嚴重危害人類生命和健康，溶栓療法是主要的臨床治療手段[1]。目前臨床使用的鏈激酶、尿激酶等藥物雖然具有顯著的溶栓療效，但是半衰期短、副作用較大[2]。研究表明，納豆激酶、蚓激酶等纖溶酶能夠直接作用于血栓成分-血纖維蛋白，可以迅速、完全的溶解血纖維蛋白，且不會增加內(nèi)出血等風險[3]。因此，從植物、動物和微生物中尋找纖溶活力更高、專一性更強、成本更低的纖溶酶成為目前的研究熱點[4-6]。微生物生長周期短、代謝產(chǎn)物多樣、易于大規(guī)模培養(yǎng)，是開發(fā)新型纖溶酶的主要來源。目前，已從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[6]、假單胞菌(Pseudomonas)[7]、短炭角菌(Xylariacurta)[8]、曲霉菌(Aspergillus)[9,10]、蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)[11]等微生物中獲得了纖溶酶。

纖溶酶作為功能食品或藥品原料，其來源的安全性至關(guān)重要。來源于安全性細菌(如枯草芽孢桿菌)的纖溶酶，如納豆激酶等已有大量的報道[6,12]。但是，來源于安全性霉菌的纖溶酶還很少見。好食脈孢霉是FDA組織認證的安全性(GRAS)真菌，在印度尼西亞、巴西和婆羅洲生活的居民食用好食脈孢霉發(fā)酵食品已有悠久歷史[13,14]。本文使用的好食脈孢霉分離自發(fā)酵豆制品，前期研究中發(fā)現(xiàn)在其固體發(fā)酵豆渣基質(zhì)的胞外代謝產(chǎn)物中含有較高活力的纖溶酶，與現(xiàn)有一些報道相比，好食脈孢霉產(chǎn)纖溶酶周期較短，酶活力較高，生產(chǎn)成本較低，具有開發(fā)為溶栓藥物的潛力[9-11]。酶的分離純化和功能性質(zhì)研究是合理開發(fā)纖溶酶的基礎(chǔ)，本文介紹了好食脈孢霉纖溶酶的分離純化方法和體外纖溶活性，希望通過本文的研究可以為該纖溶酶在溶栓藥物研制中的應用提供部分依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

好食脈孢霉(Neurosporasitophila)，分離自發(fā)酵豆制品，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號CGMCC No.1836。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要實驗儀器

層析柱26/20、層析柱26/40(GE Life Sciences)；Millicup抽濾裝置(Millipore)；CF15RXII高速冷凍離心機(Hitachi)；AKTAPrime Plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(GE Life Sciences)。

1.2.2 主要實驗試劑

人血纖維蛋白原、十二烷基硫酸鈉、瓊脂糖、牛纖維蛋白原、尿激酶、凝膠過濾低分子量標準品(Sigma公司)；凝血酶(天津血液制品研究所)；Octyl Sepharose FF、Sephadex G-25、CM-Sepharose HP、SP-Sepharose HP(GE Life Sciences)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)低分子量標準蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、N-甲苯磺?；?L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)、苯基甲烷磺酰氟(PMSF)、抑肽酶(aprotinin)、胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)和賴氨酸(生工生物工程(上海)股份有限公司)；其余試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 好食脈孢霉纖溶酶粗酶液的制備

固體發(fā)酵：培養(yǎng)基由豆渣和麩皮組成，比例為4∶1，添加麩皮量7%(V/W)的CaCl2溶液(濃度為0.75%，W/V)和 FeSO4·7H2O溶液(濃度為0.045%，W/V)，料水比例為1∶4，pH自然。采用規(guī)格為30 cm×20 cm×3.5 cm的淺盤進行發(fā)酵，接種量為2×104個孢子/克干基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

粗酶液的制備：利用生理鹽水浸提發(fā)酵產(chǎn)物2 h，在4 ℃、6 000 rpm離心15 min后收集上清液，通過40%～80%(W/V)飽和度的硫酸銨分級鹽析后，在4 ℃、10 000 rpm離心20 min分離沉淀，經(jīng)0.02 mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)復溶沉淀后得到粗酶液。

1.4 纖溶酶的分離純化

1.4.1 Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析

將粗酶液的硫酸銨飽和度調(diào)至40%(W/V)進行疏水相互作用層析。平衡緩沖液：含40%(W/V)飽和度硫酸銨的0.02 mol/LpH7.4PBS；洗脫緩沖液：依次為含40%、20%、0%(W/V)飽和度硫酸銨的平衡液；流速：2.0 mL/min；上樣量：50 mL；蛋白質(zhì)濃度：5.23 mg/mL；洗脫方式：步階式洗脫。收集纖溶活性組分進行下一步分離。

1.4.2 Sephadex G-25 凝膠過濾層析

利用Sephadex G-25凝膠過濾層析對Octyl-Sepharose FF收集的活性組分脫鹽和更換緩沖液。蛋白濃度：0.272 mg/mL；洗脫緩沖液：0.02 mol/LpH6.0PBS；流速：2.0 mL/min；上樣量：35 mL。收集纖溶活性組分進行下一步層析。

1.4.3 CM-Sepharose FF弱陽離子交換層析

利用CM-Sepharose FF弱陽離子交換層析進一步純化纖溶活性組分。平衡緩沖液：0.02 mol/LpH6.0PBS；洗脫液：含0.5 mol/L NaCl的平衡緩沖液。上樣量：55 mL；蛋白濃度：0.252 mg/mL；流速：2.0 mL/min。收集纖溶活性組分進行下一步層析。

1.4.4 SP-Sepharose HP 強陽離子交換層析

利用Sephadex G-25凝膠過濾層析對經(jīng)CM-Sepharose FF弱陽離子交換層析純化的纖溶酶組分進行脫鹽和更換緩沖液，收集活性組分進行SP-Sepharose HP 強陽離子交換層析。平衡緩沖液：0.02 mol/LpH6.0PBS；洗脫液：含0.5 mol/L NaCl的平衡緩沖液。上樣量：50 mL；蛋白濃度：0.09 mg/mL；流速：2.0 mL/min。收集纖溶活性組分。

1.5 纖溶酶純度及分子量的鑒定

利用SDS-PAGE檢驗纖溶酶的純度，分離膠濃度為12%(W/V)。采用SDS-PAGE和凝膠過濾法鑒定纖溶酶的分子量。凝膠過濾色譜柱為Superdex75 16/60預裝柱，洗脫液：含0.3 mol/L的NaCl的0.02 mol/LpH7.4PBS；流速：0.5 mL/min。分離標準品后繪制標準曲線，得到方程：y=-0.406 8x+ 14.95(y代表分子量對數(shù)，x代表洗脫體積)，R2=0.9 884。

1.6 纖溶酶的體外纖溶活性研究

1.6.1 各種蛋白酶抑制劑對纖溶酶活力的影響

將1 mmol/L 的抑肽素(pepstatin)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶(aprotinine)、甲苯磺酰氨基苯乙基氯甲基酮(TPCK)、大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、Lys溶液與纖溶酶等體積混合，其中EDTA、PMSF、aprotinine、SBTI和Lys用雙蒸水配制，pepstatin用甲醇配制(已做實驗證明甲醇對酶活有輕微抑制作用)，TPCK用DMSO配制(已做實驗證明DMSO對酶活無影響)，37 ℃分別水浴15 min和30 min，以雙蒸水和甲醇(是pepstatin的對照)作為對照，測殘余酶活。

1.6.2 纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解

根據(jù)Liu等的方法檢測纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解情況，略有改進[8]。SDS-PAGE分離膠濃度12%(W/V)，將2%(W/V)人血纖維蛋白原(溶于0.05 mol/LpH7.6Tris-HCl緩沖液)200 μL與20 μL2.7 mg/mL的酶液(7.625 U/mL)混勻，在37 ℃保溫5 min、45 min、1 h、2 h、6 h、9 h和24 h后進行SDS-PAGE，以還原的人血纖維蛋原作對照，確定纖溶酶對人血纖維蛋白原各亞基的降解情況。

1.6.3 纖溶酶激活纖溶酶原的分析

通過血纖維蛋白平板法研究純化的纖溶酶降解血纖維蛋白的方式[11]。將血纖維蛋白平板在85 ℃加熱30 min，得到無纖溶酶原平板，以未經(jīng)處理的平板為對照，將纖溶酶液點加至兩種平板上，在37 ℃保溫2、4、6、9、12 h后測定溶圈面積，計算纖溶活力。

1.6.4 纖溶酶對人血清白蛋白的降解

采用SDS-PAGE檢測纖溶酶對人血清白蛋白的降解情況，分離膠濃度12%(W/V)。將200 μL 2%(W/V)的人血清白蛋白(溶于0.05 mol/LpH 7.6Tris-HCl 緩沖液)與20 μL 2.7 mg/mL的酶液(7.625 U/mL)混勻，在37 ℃分別保溫30 min、2 h、6 h和12 h，定時取樣進行SDS-PAGE，以還原的人血清白蛋白為對照，確定纖溶酶對人血清白蛋白的降解情況。

1.7 纖溶酶活力的測定

纖溶酶活力的測定采用血纖維蛋白平板法[11]。血纖維蛋白平板制備方法(以配制10個平板為例)：將0.25 g瓊脂糖溶于50 mL生理鹽水，置于45 ℃水浴中保溫30 min后加200 U的凝血酶混勻；0.2 g牛血纖維蛋白原溶于巴比妥鈉-鹽酸緩沖液(pH7.8)，置45 ℃水浴中保溫5 min。分別取5 mL凝血酶溶液和5 mL牛血纖維蛋白原溶液迅速混合倒平板，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩＠w溶酶活力測定：將10 μL樣品溶液點加在血纖蛋白平板表面，37 ℃保溫6 h。使用尿激酶作為標準，通過測量平板表面的透明區(qū)域面積定量酶的活性。

1.8 蛋白質(zhì)濃度的測定

以牛血清白蛋白為標準蛋白，根據(jù)參考文獻[11]的方法測蛋白質(zhì)濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖溶酶的分離純化

好食脈孢霉纖溶酶粗酶液經(jīng)Octyl-Sepharose FF疏水相互作用層析分離后得到三個活性組分(圖1)，其中活性峰組分2的蛋白吸收峰與纖溶活性峰對應，收集峰2進行脫鹽和更換緩沖液，然后依次經(jīng)過CM-Sepharose FF 弱陽離子交換層析(圖2)和SP-Sepharose HP 強陽離子交換層析(圖3)分離，最終得到單一的色譜洗脫峰，經(jīng)過上述步驟純化后，纖溶酶活性回收率為3.05%，比活力為519.59 U/mg，純化倍數(shù)為86.60倍(表1)。雖然該分離路線使纖溶酶的純度得到了較大程度提高，但是與短炭角菌(Xylariacurta)[8]、擬青霉(Paecilomycestenuipes)[15]等真菌纖溶酶的純化路線相比，活性回收率偏低，因此該路線還有進一步優(yōu)化的空間。

圖1 Octyl-Sepharose FF 疏水相互作用層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of Octyl-Sepharose FF hydrophobic interaction chromatography

圖2 CM-Sepharose FF離子交換層析洗脫曲線Fig.2 Elution profile of CM-Sepharose FF ion exchange chromatography

表1 好食脈孢霉纖溶酶純化步驟總結(jié)Table 1 Summary of purification steps of fibrinolytic enzyme from Neurospora sitophila

圖3 SP-Sepharose HP離子交換層析洗脫曲線Fig.3 Elution profile of SP-Sepharose HP ion exchange chromatography

2.2 纖溶酶的純度鑒定及分子量測定

利用SDS-PAGE檢驗了純化后纖溶酶的純度，結(jié)果見圖4。好食脈孢霉纖溶酶經(jīng)過純化后在電泳圖譜中顯示兩條帶，推測該酶可能是由兩個亞基組成。

圖4 利用SDS-PAGE測定纖溶酶分子量Fig.4 Determination of the molecular weight of the fibrinolytic enzyme using SDS-PAGE注：泳道1為純化后的纖溶酶，泳道Marker是標準分子量標記。Note:Lane 1:purified enzyme;Lane Marker:molecular mass markers.

采用SDS-PAGE和凝膠過濾法檢測了纖溶酶的分子量。如圖4所示，純化后的纖溶酶樣品經(jīng)SDS-PAGE后在電泳圖譜中顯示有兩個組分，分子量分別為30.0 kDa和15.5 kDa。經(jīng)Superdex 75凝膠過濾分離后的洗脫體積為10.19 mL，經(jīng)計算分子量約為49.2 kDa。兩種檢測方法得到的纖溶酶分子量略有差異，可能是因為纖溶酶分子形狀非球形導致凝膠過濾法測得的分子量偏大，但是，根據(jù)凝膠過濾法測得的結(jié)果可以判斷該酶由兩個亞基組成。

綜合SDS-PAGE和凝膠過濾法可確定該纖溶酶由2個亞基組成，分子量分別為30.0 kDa和15.5 kDa。不同微生物來源的纖溶酶分子量跨度較大，裂褶菌(Schizophyllumcommune)KCTC 6482纖溶酶的分子量只有17 kDa[16]；假單胞菌(Pseudomonasbaetica)SUHU25纖溶酶與本文纖溶酶分子量相似，約為42 kDa[7]；而分離自繡球菌(Sparassiscrispa)Wulf.ex.Fr.的纖溶酶分子量高達90 kDa[17]。但是，由兩個亞基組成的纖溶酶分子的報道還很少見。

圖5 不同抑制劑對纖溶酶活力的影響Fig.5 Effect of different inhibitors on the fibrinolytic activity of purified enzyme from Neurospora sitophila注：抑制劑1～9分別是EDTA、Lys、TPCK、SBTI、PMSF、aprotinine、ppstatin、雙蒸水和甲醇。Note:Inhibitors1-9 are EDTA,Lys,TPCK,SBTI,PMSF,aprotinine,pepstatin,ddH2O and methanol,respectively.

2.3 脈孢霉纖溶酶的纖溶性質(zhì)

2.3.1 蛋白酶抑制劑對纖溶酶的影響

將1 mmol/L的七種蛋白酶抑制劑與純化后的纖溶酶共同保存15 min和30 min后測定纖溶酶活力，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，PMSF對纖溶酶的活性有顯著抑制作用，絲氨酸蛋白酶抑制劑SBTI、Lys和胰凝乳蛋白酶抑制劑TPCK與酶共存30 min時也對酶活力表現(xiàn)出抑制作用，說明好食脈孢霉纖溶酶是一種絲氨酸蛋白酶，有與胰凝乳蛋白酶、絲氨酸蛋白酶相似的活性中心。已見報道的多數(shù)纖溶酶都屬于絲氨酸蛋白酶，例如米曲霉纖溶酶[10]、納豆激酶[12]等。1 mmol/L的金屬蛋白酶抑制劑EDTA不抑制纖溶酶活性，說明該酶活性中心不含金屬結(jié)合位點，這與蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)[11]、海洋鏈霉菌(Streptomycessp.)MY0504[18]的纖溶酶相似，但是與裂褶菌(Schizophyllumcommune)KCTC 6482[16]、特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)[19]產(chǎn)的纖溶酶完全相反。

2.3.2 纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解

利用SDS-PAGE檢測纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解。人血纖維蛋白原在凝血酶的作用下可以凝聚為血纖維蛋白，而血纖維蛋白是構(gòu)成血栓的主要組分[1]，因此，檢測純化的纖溶酶在體外對人血纖維蛋白原的降解情況可以說明纖溶酶的溶栓潛力。纖溶酶與人血纖維蛋白原不同保存時間的樣品的SDS-PAGE圖譜見圖6。

圖6 利用SDS-PAGE分析纖溶酶降解人血纖維蛋白原情況Fig.6 Analysis of reduced human fibrinogen after digestion by the purified enzyme by SDS-PAGE注：泳道C是對照；泳道1～7分別為纖溶酶降解人血纖維蛋白5 min、45 min、1 h、2 h、6 h、9h和24 h的樣品。Note:Lane C:Control;Lanes 1-7:Degradation pattern of fibrinogen at different time intervals of 5 min,45 min,1 h,2 h,6 h,9h and 24 h,respectively.

如圖6所示，與好食脈孢霉纖溶酶共存5 min時，人血纖維蛋白原的Aα、Bβ和γ三條肽鏈均有不同程度的降解，當共存45 min時Aα和Bβ鏈已經(jīng)完全降解，當共存6 h時γ鏈完全降解。人血纖維蛋白原的Aα鏈C末端結(jié)構(gòu)相對松散，易于被外源纖溶酶降解，例如PTEFP纖溶酶只能水解人血纖維蛋白原的Aα鏈，不能水解Bβ和γ鏈[3,15]。好食脈孢霉纖溶酶能完全降解人血纖維蛋白原的三個亞基，作用方式與蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)纖溶酶相似[11]。

2.3.3 纖溶酶激活纖溶酶原的分析

市售的牛血纖維蛋白原中含有殘余的纖溶酶原，因此配制的血纖維蛋白平板中含有纖溶酶原，將配制好的血纖維蛋白平板在85 ℃下保溫30 min，鈍化纖溶酶原，經(jīng)過這樣處理的平板稱為陰性平板，不經(jīng)過此處理的平板稱為陽性平板[11]。平板法測定好食脈孢霉纖溶酶作用方式的結(jié)果見圖7。

圖7 純化的纖溶酶激活纖溶酶原的分析(n =3)Fig.7 Analysis of plasminogen activation by the purified fibrinolytic enzyme(n =3)注：同組列中帶有不同上標的值存在顯著差異(P<0.05)。Note:Values with the different superscript within the column of same group are significantly different (P<0.05).

如圖7所示，在保溫不同時間時，好食脈孢霉纖溶酶在陽性平板上測得的酶活力顯著大于陰性平板(P<0.05)，說明好食脈孢霉纖溶酶不僅可以直接降解血纖維蛋白，還具有激活纖溶酶原間接促進血纖維蛋白降解的功能。報道表明，不同來源的纖溶酶可能具有不同的纖溶方式，一些纖溶酶直接降解血纖維蛋白[17]，還有一些纖溶酶具有激活纖溶酶原的功能[16]，但是，也有少數(shù)纖溶酶與好食脈孢霉纖溶酶相似，兼具上述兩種功能，如蛹蟲草纖溶酶、納豆激酶[11,12]。

2.3.4 纖溶酶對人血清白蛋白的降解

人血清白蛋白是血漿的主要組成成分，在機體中執(zhí)行多種生理功能，例如控制滲透壓、轉(zhuǎn)運生物分子等[20]。利用SDS-PAGE檢測好食脈孢霉纖溶酶對人血清白蛋白的降解情況，結(jié)果見圖8。

如圖8所示，好食脈孢霉纖溶酶與人血清白蛋白共存12 h范圍內(nèi)未降解人血清白蛋白。這與蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)纖溶酶不同，蛹蟲草纖溶酶與人血清白蛋白共存4 h時即對其產(chǎn)生了降解[11]。好食脈孢霉纖溶酶不降解人血清白蛋白，并且由圖5和圖6可知，該酶具有降解人血纖維蛋白原和激活纖溶酶原的雙重功能，與已開發(fā)為藥品的納豆激酶、蚓激酶溶解血纖維蛋白的方式相似，因此，極具有開發(fā)為溶栓藥物的潛力[3]。

圖8 纖溶酶對人血清白蛋白的影響Fig.8 Effect of purified enzyme on human serum albumin注：泳道C是人血清白蛋白對照；泳道1～4分別為纖溶酶降解人血清白蛋白30 min、2 h、6 h和12 h的樣品。Note:Lane C:Control of HSA;Lanes 1-4:Degradation pattern of human serum albumin at different time intervals of 30 min,2 h,6 h and 12 h,respectively.

3 結(jié)論

采用多種層析模式相結(jié)合的純化方式從公認安全菌株好食脈孢霉(Neosporasitophila)的胞外代謝產(chǎn)物中純化了一種纖溶酶，純化倍數(shù)為86.6倍，比活力為519.59 U/mg。該酶是一種絲氨酸蛋白酶，能順次降解人血纖維蛋白原的Aα、Bβ和γ鏈。該酶不僅可以直接溶解血纖維蛋白，還可以作為纖溶酶原激活劑。此外，該酶不降解人血清白蛋白。上述結(jié)果表明，好食脈孢霉纖溶酶具有開發(fā)為預防血栓形成和治療血栓疾病的藥物的潛力。