柚皮素增加自噬抑制泡沫細(xì)胞的形成

陳雨露，杜延飛，鄭文武，李 光，鄭舒展*

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科；2西南醫(yī)科大學(xué)心血管研究所，瀘州 646000

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性動(dòng)脈疾病，影響動(dòng)脈內(nèi)中外三層膜的功能，它的特征是動(dòng)脈壁上的內(nèi)膜斑塊的增厚和膽固醇的堆積[1]。動(dòng)脈粥樣硬化所致的心血管疾病在西方國家中占有很高的致死率[2]。泡沫細(xì)胞的形成在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵性作用，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性病理細(xì)胞[3]，主要是由單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞吞噬大量氧化修飾的低密度脂蛋白形成，其分泌多種炎癥因子及基質(zhì)代謝酶可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，破壞纖維的膠原成分，導(dǎo)致粥樣斑塊不穩(wěn)定和急性心血管事件的發(fā)生[4,5]。自噬是細(xì)胞器及蛋白質(zhì)聚集體等細(xì)胞質(zhì)組分通過溶酶體裝置分解和回收的機(jī)制。自噬維持細(xì)胞代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是一種細(xì)胞修復(fù)過程，自噬功能的缺陷可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[6,7]。柚皮素是天然的黃酮類化合物，對動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用[8]，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。本研究觀察柚皮素對泡沫細(xì)胞形成的影響以及探討是否通過自噬途徑發(fā)揮作用，為其防治動(dòng)脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞株THP-1(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)(武漢普諾賽生命科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；青鏈霉素(中國碧云天公司)。

1.1.2 試劑

柚皮素(naringenin)(中國思域化工)；PMA、3MA(美國Sigma公司)；氧化低密度脂蛋白o(hù)x-LDL(廣州奕源生物科技有限公司)；cck-8試劑盒(中國碧云天公司)；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)(美國MedChemExpress公司)；compound C、飽和油紅O染色液(中國索萊寶公司)；LC3、SQSTM1/p62、AMPK、p-AMPK抗體(美國CST公司)；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(上海斯信生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器

Heracell 150i CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific公司)；Infinite M200全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；IX71-F22PH倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；SW-CJ-2G型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司)；低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Sim-140制冰機(jī)(日本SANYO公司)；BS224S電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 方法

1.2.1 泡沫細(xì)胞模型的構(gòu)建及分組

使用含10% FBS和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞于CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后用160 nmol/L PMA的無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h，使其成為THP-1源性的巨噬細(xì)胞。再將得到的巨噬細(xì)胞用50 μg/mL ox-LDL 3%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h成為泡沫細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)共分為3個(gè)組，第1組為：空白對照組(不加入任何干預(yù)藥物)，模型組(加入50 μg/mL ox-LDL)，不同濃度的柚皮素組(50 μg/mL ox-LDL+10、25、50、100 μmol/L柚皮素)；第2組為：空白對照組，模型組，柚皮素組(50 μg/mL ox-LDL+100 μmol/L柚皮素)，雷帕霉素組(50 μg/mL ox-LDL+100 nmol/L雷帕霉素)，3MA組(50 μg/mL ox-LDL+5 mmol/L 3MA)；第3組為：為空白對照組，模型組，柚皮素組，compound C組(50 μg/mL ox-LDL +10 μmol/L AMPK拮抗劑compound C)，柚皮素與compound C共處理組(50 μg/mL ox-LDL +10 μmol/L compound C+100 μmol/L柚皮素)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測

將正處于對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞與160 nmol/L PMA的無血清培養(yǎng)基配制成濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，再按照每孔104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，安置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，再按照CCK-8試劑盒說明書操作，加入不同濃度的柚皮素(0、5、10、25、50、100 μmol/L)，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長下的光吸收值。

1.2.3 油紅O染色

用上述方法將THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞配置成濃度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按照每個(gè)孔106個(gè)細(xì)胞均勻接種于6孔板中，分為2組，按照上述空白對照組及模型組處理后，用PBS漂洗3次，再用4%多聚甲醛在37 ℃固定15 min，用PBS漂洗2次，油紅O染色25 min，60%異丙醇漂洗5 s，再用PBS漂洗3次。顯微鏡下觀察，按文獻(xiàn)所述：胞內(nèi)較大紅染顆粒≥5個(gè)即可判定為泡沫細(xì)胞[9]。

1.2.4 Western blot(蛋白質(zhì)免疫印跡法)

收集上述分組處理好的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并采用BCA法測蛋白濃度。分別使用10%、12%分離膠進(jìn)行凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣量為20 μg，按照濃縮膠70 V，分離膠110 V進(jìn)行恒壓電泳，切取需要的膠帶，400 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶封閉1 h，將一抗按1∶1 000比例稀釋后于4 ℃孵育過夜，次日用TBST漂洗3次，每次10 min，后用HRP標(biāo)記的羊抗兔或者羊抗鼠二抗(1∶2 000)于室溫孵育2 h，再加TBST搖床洗膜3次，每次10 min，使用化學(xué)發(fā)光法顯影，拍照保存進(jìn)行分析，使用Quantity One圖像分析軟件分析條帶，分析目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的測定

將收集的細(xì)胞制成懸液后用1 000 rpm離心10 min，去掉上清液，收集細(xì)胞樣本后使用超聲波破碎細(xì)胞以獲得勻漿液，再按照總膽固醇測定試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量(TC)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞模型的建立

油紅O染色結(jié)果如圖1。結(jié)果表明：空白對照組與模型組相比較，模型組細(xì)胞內(nèi)有大量紅染脂滴顆粒，且胞內(nèi)較大紅染顆?！?個(gè)，細(xì)胞模型成功建立。

圖1 泡沫細(xì)胞模型的建立(油紅O染色，×400)Fig.1 Establishment of foam cell model (oil red O staining,×400)注：A：空白對照組；B：模型組(ox-LDL 50 μmol/L)。Note:A:Control group;B:Model group (ox-LDL 50 μmol/L).

2.2 不同濃度的柚皮素對細(xì)胞的毒性影響

使用CCK-8試劑盒測定不同濃度的柚皮素對細(xì)胞的活性影響以排除其毒性影響。結(jié)果見圖2，細(xì)胞活力=[ (加藥細(xì)胞OD-空白OD)/ (對照細(xì)胞OD-空白OD) ] ×100%，結(jié)果表明，當(dāng)柚皮素濃度大于等于5 μmol/L時(shí)，柚皮素對細(xì)胞活性無毒性影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 柚皮素對細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of naringenin on cell activity注：與空白對照組相比，P>0.05。Note:Compared with control,P>0.05.

2.3 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 不同濃度的柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，模型組LC3II/LC3I比值降低，p62升高(P<0.05)；隨著柚皮素濃度的增加，25 μmol/L以上濃度的柚皮素增加泡沫細(xì)胞的自噬水平，主要表現(xiàn)為LC3II/LC3I比值增加，P62蛋白水平降低，在100 μmol/L時(shí)作用最明顯(P<0.05)，故選擇100 μmol/L的柚皮素為使用濃度。

2.3.2 不同濃度柚皮素對泡沫細(xì)胞總膽固醇含量的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，模型組的細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量高(P<0.05)，隨著柚皮素濃度增加，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量逐漸降低，在柚皮素濃度為100 μmol/L時(shí)最低(P<0.05)。

2.3.3 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，模型組的LC3II/LC3I的比值降低，P62蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)，自噬水平降低；與模型組相比較，柚皮素組與Rapa組的LC3II/LC3I的比值都增加，3MA組比模型組的LC3II/LC3I的比值降低(P<0.05)；柚皮素組與Rapa組相比，LC3II/LC3I的比值更高，并且P62表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)。

2.4 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬影響的機(jī)制探討

如圖6所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組相比較，模型組p-AMPK/AMPK與LC3II/LC3I比值均降低，與模型組相比，柚皮素組p-AMPK/AMPK比值與LC3II/LC3I比值均升高(P<0.05)；compound C組與compound C+柚皮素共處理組結(jié)果一致，與模型組相比p-AMPK/AMPK與LC3II/LC3I比值均降低(P<0.05)。

圖3 不同濃度的柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬的影響Fig.3 Effects of different concentrations of naringenin on autophagy of foam cells注：與空白對照組相比，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

圖4 不同濃度柚皮素對泡沫細(xì)胞膽固醇含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of naringenin on cholesterol content in foam cells注：與空白對照組相比，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

2.5 柚皮素對泡沫細(xì)胞膽固醇含量的影響

如圖7所示，模型組比空白對照組的總膽固醇含量增多，而柚皮素組比模型組顯著減少(P<0.05)； compound C組與compound C+柚皮素共處理組結(jié)果一致，均為與模型組相比，總膽固醇含量增多(P<0.05)。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是在動(dòng)脈硬化的血管病中最常見的一種，是由多種病因，多種因素作用于不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生，在心血管疾病中，有著很高的死亡率[10]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未完全確定，但巨噬細(xì)胞相關(guān)膽固醇代謝異常是主要原因之一，動(dòng)脈內(nèi)膜受損，巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的起點(diǎn)[11]。

自噬是一種保守的分解代謝過程，在多種疾病的多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，可將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器傳遞到溶酶體進(jìn)行降解和循環(huán)[12]，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。過度的自噬已被證明是致病的，許多研究報(bào)道了自噬在冠心病中發(fā)生的意義，自噬可能在冠心病患者血清白蛋白降低的相關(guān)心血管事件中發(fā)揮作用；自噬對冠心病患者的巨噬細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白的降解有保護(hù)作用[13-15]。但自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中的具體作用機(jī)制尚不明確。研究表明，自噬延緩了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，但是有缺陷的自噬加快了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[16,17]。

柚皮素是天然的黃酮類化合物，主要存在于葡

圖5 柚皮素促進(jìn)泡沫細(xì)胞自噬Fig.5 Naringenin promotes autophagy of foam cells注：與空白對照組相比，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與Rapa組比較，▲P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05;Compared with Rapa,▲P<0.05.

圖6 柚皮素對泡沫細(xì)胞自噬影響的機(jī)制探討Fig.6 Mechanism of effect of naringenin on autophagy of foam cells注：與空白對照組相比，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

萄柚和橙子中，它的結(jié)構(gòu)與廣泛研究的多酚白藜蘆醇相似，具有潛在的健康益處[18]，有研究表明，柚皮素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[19]，柚皮素可以增加THP-1源性巨噬細(xì)胞的膽固醇外排[20]。但柚皮素防治動(dòng)脈粥樣硬化的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，鑒于黃酮類化合物可能有促進(jìn)自噬活性的作用[21,22]，我們推測，柚皮素可能通過增加自噬來減輕粥樣硬化斑塊病變，從而對動(dòng)脈粥樣硬化起保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，泡沫細(xì)胞的形成伴有自噬能力的受損，表現(xiàn)為LC3II/LC3I比值降低，P62水平升高。25 μM以上濃度的柚皮素呈濃度依賴性的增加巨噬細(xì)胞自噬流水平，在100 μM作用最強(qiáng)。與自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素相比，柚皮素升高LC3II的作用更明顯。同時(shí)25 μM以上濃度的柚皮素濃度依耐性地降低巨噬細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量，抑制泡沫細(xì)胞的形成。

圖7 柚皮素對泡沫細(xì)胞膽固醇含量的影響Fig.7 Effect of naringenin on cholesterol content of foam cells注：與空白對照組相比，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:Compared with control, *P<0.05;Compared with model, #P<0.05.

為進(jìn)一步探討柚皮素促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬的機(jī)制，我們選擇自噬通路的調(diào)節(jié)因子AMPK作為觀察指標(biāo)。AMPK是細(xì)胞能量代謝的傳感器，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以維持能量穩(wěn)態(tài)，包括脂質(zhì)代謝，并通過ULK-1激活自噬，并且促進(jìn)自噬[23]。Wu等[24]研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚通過上調(diào)自噬和激活A(yù)MPK磷酸化來達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，還有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，黃連素可以通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)的自噬來預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[25]，而且morin可通過激活HUVECs中的AMPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)自噬，從而減輕ox-LDL介導(dǎo)的損傷[26]。本研究結(jié)果顯示，AMPK抑制劑compound C可降低磷酸化AMPK的水平，降低LC3II/LC3I的比值；增加泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。說明AMPK可能通過影響自噬參與巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的調(diào)節(jié)。而柚皮素能夠增加泡沫細(xì)胞內(nèi)磷酸化AMPK的水平，促進(jìn)自噬。另外，將柚皮素處理的泡沫細(xì)胞預(yù)防性加入AMPK抑制劑compound C，compound C抑制了柚皮素對泡沫細(xì)胞的降膽固醇作用。說明柚皮素通過增加AMPK磷酸化而促進(jìn)自噬。

綜上，柚皮素的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能與其增加泡沫細(xì)胞的自噬有關(guān)，柚皮素可通過增加AMPK磷酸化水平促進(jìn)自噬，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化中泡沫細(xì)胞的形成，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。