蜂膠中提取的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯抑制食管癌Eca109細(xì)胞的功效

劉 會(huì)，袁雯雯，李俊雅，玄紅專

聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城 252059

蜂膠是蜜蜂采集植物樹(shù)脂并混入其上顎腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物[1]。由于植物來(lái)源不同，蜂膠的化學(xué)成分非常復(fù)雜。世界不同地區(qū)的蜂膠大致分為七類，分別是：“楊樹(shù)型”蜂膠、“樺樹(shù)型”蜂膠、巴西綠膠、紅膠、太平洋蜂膠、地中海蜂膠以及“克魯西屬”蜂膠[2]。中國(guó)蜂膠屬于楊樹(shù)型蜂膠并且其主要的化學(xué)組分是黃酮類及酚酸類。到目前為止，已有600種以上的成分從蜂膠中鑒定出來(lái)[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蜂膠具有抑菌[4]、抗炎[5,6]、抗病毒[7]、抗腫瘤[8]、抗氧化[9]及免疫調(diào)節(jié)[10,11]等功效。

研究表明蜂膠對(duì)多種不同腫瘤細(xì)胞具有較好的抑制功效[12-14]，特別是蜂膠中短葉松素、咖啡酸芐酯(CABE)、咖啡酸苯乙酯(CAPE)、芹菜素、松屬素、白楊素和高良姜素等[15]。食管癌是一種嚴(yán)重的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的身體健康。由于食管癌細(xì)胞高度浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，使得該疾病的治療和預(yù)后效果都較差[16,17]。從天然產(chǎn)物中發(fā)掘抑制食管癌的藥物也是食管癌治療的一個(gè)重要方向。CAPE和CABE是蜂膠中的兩種重要酯類，但它們對(duì)食管癌的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究重點(diǎn)研究了CAPE和CABE對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞的抑制功效及作用機(jī)理，為蜂膠應(yīng)用于食管癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中國(guó)蜂膠產(chǎn)自山東省(購(gòu)于蜂農(nóng))，主要膠源植物為楊樹(shù)。主要試劑包括：DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；胰酶、磺酰羅丹明B(SRB)、Hoechst 33258、活性氧檢測(cè)熒光探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)和線粒體膜電位熒光探針JC-1(美國(guó)Sigma公司)；Matrigel膠和Transwell孔板(美國(guó)Corning公司)、DAPI染料(美國(guó)Genview公司)、抗體Caspase-3、PARP(美國(guó)Cell Signaling Technology)、β-actin (美國(guó)Santa Cruz Biotechnology)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其它試劑均為分析純。

Eca109細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；TE2000S 倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus)；電泳儀和電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司)；MK3酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 CAPE和CABE的制備方法

CAPE和CABE的制備方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[18,19]。首先將中國(guó)蜂膠冷凍，粉碎，用熱水浸提，過(guò)濾，濾液減壓濃縮。然后向濃縮液中加入95%乙醇至乙醇含量為70%左右，靜置過(guò)夜，取上清液濃縮得浸膏。再用大孔吸附樹(shù)脂粗分離，再依次用0%、20%、40%、60%、80%、95%乙醇-水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，分別收集洗脫部分，濃縮，得粗分樣品。將粗分樣品用半制備型高效液相色譜進(jìn)行分離純化，色譜柱為C18SMB 100柱(400 mm×25.4 mm，10 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，根據(jù)采集到的色譜圖手動(dòng)收集各個(gè)目標(biāo)組分餾分，將得到的餾分減壓濃縮。對(duì)于高純度的餾分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振、X射線單晶衍射等手段進(jìn)行鑒定，得到CAPE和CABE。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

食管癌Eca109細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，孵育條件為：5% CO2、37 ℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 細(xì)胞存活率的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按4 000個(gè)/孔種植到96孔板，24 h后，除正常組外，處理組細(xì)胞分別經(jīng)CAPE(80 μM)和CABE(80 μM)處理后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸4 ℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，100 mmol/L Tris堿溶解，在492 nm處測(cè)吸光值。

細(xì)胞存活率=(處理組OD值/對(duì)照組OD值)

×100%

1.3.4 DAPI染色

DAPI 染色主要用于觀察細(xì)胞核的形態(tài)，在48 h，所有細(xì)胞用300 nM DAPI染液室溫孵育5 min，細(xì)胞經(jīng)1×PBS輕輕漂洗2～3次，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)并拍照。

1.3.5 LDH分析

在48 h收集對(duì)照組和處理組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心。上清液中的LDH含量按照試劑盒的操作進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞，消化，調(diào)整細(xì)胞密度到5×105個(gè)/mL，Transwell上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室中加入750 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育48 h。用濕棉簽擦掉上室上面的Matrigel和非侵襲細(xì)胞，上室下面用95%酒精室溫固定10 min，然后用0.1%結(jié)晶紫繼續(xù)固定染色15 min，高倍鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)。直徑上取4個(gè)視野，求其平均值。

1.3.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

在24孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用10 μL白槍尖垂直在細(xì)胞表面劃線，然后用1×PBS輕輕沖洗掉細(xì)胞碎片。按照實(shí)驗(yàn)分組，細(xì)胞分別經(jīng)CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)處理48 h，每12 h在倒置相差顯微鏡下觀察、拍照細(xì)胞遷移情況。用Image-Pro Plus軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.3.8 活性氧(ROS)水平的檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞按4×104個(gè)/mL種植到共聚焦小皿中。待細(xì)胞長(zhǎng)到60%以上，除正常組外，處理組細(xì)胞分別經(jīng)CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)處理24 h。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用1×PBS清洗1次，加DCFH-DA應(yīng)用液1 mL，37 ℃孵育30 min。棄DCFH-DA應(yīng)用液，用1 ×PBS漂洗3次，每次5 min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.9 線粒體膜電位檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞按4×104個(gè)/mL種植到共聚焦小皿中。待細(xì)胞長(zhǎng)到60%以上，除正常組外，處理組細(xì)胞分別經(jīng)CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)處理24 h。棄細(xì)胞培養(yǎng)液。用1 ×PBS清洗，加JC-1染色液500 μL，37 ℃孵育20 min。棄JC-1染色液，用1×PBS漂洗3次，每次5 min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.10 細(xì)胞蛋白提取及蛋白質(zhì)免疫印跡

CAPE(80 μM)及CABE(80 μM)分別處理細(xì)胞后收集各組細(xì)胞，在RIPA裂解液中冰上裂解30 min，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取30～40 μg總蛋白提取物上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，然后加入Caspase 3、PARP和β-actin一抗稀釋液(1∶1 000)于4℃冰箱孵育過(guò)夜。用1×PBST洗膜三次，每次5 min；再加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，1×PBST洗膜三次，每次5 min，然后ECL顯色。Quantity One進(jìn)行蛋白定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖1 蜂膠中11種組分對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effects of 11 constituents extracted from propolis on Eca109 cells注：a：咖啡酸；b：阿魏酸；c：異阿魏酸；d：3,4-二甲氧基肉桂酸；e：短葉松素；f：CABE；g：CAPE；h：芹菜素；i：松屬素；j：白楊素；k：高良姜素。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。下同。Note:a:Caffeic acid;b:Ferulic acid;c:Isoferulic acid;d:3,4-dimethoxycinnamic acid;e:Pinobanksin;f:CABE;g:CAPE;h:Apigenin;i:Pinocembrin;j:Chrysin;k:Galangin.Compared with control,*P<0.05;**P<0.01.The same below.

2 結(jié)果

2.1 蜂膠中11種組分對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響

前期我們從蜂膠中分離出11種組分，分別是咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、CABE、CAPE、芹菜素、松屬素、白楊素和高良姜素。首先檢測(cè)了這11種組分對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸對(duì)Eca109細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著的影響。CABE和CAPE顯著抑制食管癌Eca109細(xì)胞的增殖(**P<0.01，*P<0.05)。

2.2 CAPE和CABE抑制Eca109細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡

通過(guò)初步篩選可以看出CAPE和CABE顯著抑制Eca109細(xì)胞增殖，接下來(lái)我們?cè)敿?xì)研究了CAPE和CABE在不同時(shí)間和不同濃度條件下對(duì)Eca109細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在80 μM時(shí)，CAPE和CABE隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著抑制Eca109細(xì)胞的增殖，且CAPE的效果優(yōu)于CABE(圖2A)(**P<0.01，*P<0.05)；在20～160 μM時(shí)隨著濃度的增加CAPE和CABE顯著抑制Eca109細(xì)胞的增殖，且CAPE效果優(yōu)于CABE(圖2B)(*P<0.05)；通過(guò)DAPI染色發(fā)現(xiàn)CAPE和CABE(80 μM)顯著引起細(xì)胞核的斷裂和濃縮(圖3C)；LDH的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CAPE(20～80 μM)和CABE(20～160 μM)對(duì)LDH的釋放沒(méi)有顯著影響，但CAPE在160 μM時(shí)，LDH釋放顯著升高，說(shuō)明高濃度的CAPE可能引起Eca109細(xì)胞的壞死(圖2D)。

圖2 CAPE和CABE抑制Eca109細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡Fig.2 CAPE and CABE inhibited proliferation and induced apoptosis in Eca 109 cells注：A：80 μM CAPE和CABE處理Eca109細(xì)胞0、3、6、12、24和48 h后細(xì)胞存活率；B：不同濃度CAPE和CABE處理Eca109 48 h后細(xì)胞存活率；C：DAPI染色(200×)；D：CAPE和CABE處理對(duì)Eca109細(xì)胞中LDH的影響。Note:A:Eca109 cells were treated with 80 μM CAPE and CABE for 0,3,6,12,24 and 48 h;B:Cell viability of Eca109 48 h after treatment with different concentrations of CAPE and CABE;C:DAPI staining (200×);D:Effects of CAPE and CABE treatment on LDH in Eca109 cells.

2.3 CAPE和CABE抑制Eca109細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)

如圖3所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比CAPE和CABE(80 μM)顯著抑制 Eca-109細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)(**P<0.01)，并且CAPE(80 μM)對(duì)Eca109的抑制遷移功效要好于CABE。

2.4 CAPE和CABE上調(diào)Eca109 細(xì)胞中Caspase 3和PARP水平

接下來(lái)，我們檢測(cè)了CAPE和CABE對(duì)Eca109細(xì)胞中凋亡執(zhí)行者Caspase 3和PARP水平的影響。結(jié)果可以看出，CAPE 和CABE(80 μM)顯著上調(diào)了Caspase 3和PARP的水平(**P<0.01，*P<0.05)，表明CAPE和CABE誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡，而且隨著濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)，CAPE和CABE誘導(dǎo)凋亡更顯著(圖4)。

圖3 CAPE和CABE抑制Eca109細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)Fig.3 CAPE and CABE significantly suppressed the migration and invasion of Eca109 cells注：A：CAPE和CABE對(duì)Eca109細(xì)胞浸潤(rùn)的影響；B：CAPE和CABE對(duì)Eca109細(xì)胞遷移的影響；C：CAPE和CABE對(duì)細(xì)胞遷移影響的量化圖。Note:A:Effects of CAPE and CABE on Eca109 cell infiltration;B:Effects of CAPE and CABE on migration of Eca109 cells;C:Quantification of the effects of CAPE and CABE on cell migration.

2.5 CAPE和CABE 抑制Eca109細(xì)胞中Procaspase 9和Bcl-2的水平

進(jìn)一步檢測(cè)了CAPE和CABE處理Eca109 細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞中Caspase 9、Bcl-2和BAX的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAPE和CABE顯著抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)和Procaspase 9的水平(**P<0.01，*P<0.05)，而且CAPE的效果要好于CABE。CAPE和CABE對(duì)Eca109細(xì)胞中Bax的蛋白表達(dá)具有抑制趨勢(shì)。

圖4 CAPE和CABE 上調(diào)Eca109細(xì)胞中Caspase 3和PARP的水平Fig.4 CAPE and CABE obviously upregulated the levels of Caspase 3 and PARP in Eca109 cells注：A和D：Eca109細(xì)胞經(jīng)CAPE和CABE處理后PARP、Procaspase 3、Caspase 3和β-actin蛋白表達(dá)；B、C、E、F：PARP、Caspase 3蛋白量化圖。Note:A and D:Expression of PARP,Procaspase 3,Caspase 3 and β-actin in Eca109 cells treated with CAPE and CABE;B,C,E and F:Quantification of relative protein expression quantity of PARP,Caspase 3.

圖5 CAPE和CABE 抑制Eca109細(xì)胞中procaspase 9和Bcl-2的水平Fig.5 CAPE and CABE obviously down-regulated the levels of procaspase 9 and Bcl-2 in Eca109 cells注：A：Eca109細(xì)胞經(jīng)CAPE和CABE處理24 h后procaspase 9、BAX、Bcl-2和β-actin蛋白表達(dá)；B,C和D：procaspase 9、BAX和Bcl-2蛋白量化圖；E：Bcl-2和BAX的比值。Note:A:Expression of procaspase 9,BAX,Bcl-2 and β-actin in Eca109 cells treated with CAPE and CABE at 24 h.B,C and D:Quantification of relative protein expression quantity of procaspase 9,BAX and Bcl-2;E:The ratio of Bcl-2 to BAX.

2.6 CAPE和CABE上調(diào)ROS水平并降低線粒體膜電位

CAPE 和CABE (80 μM) 顯著上調(diào)Eca109細(xì)胞中的ROS水平，同時(shí)CAPE和CABE也顯著降低細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平(圖6)。

3 討論與結(jié)論

我們前期研究了蜂膠及其主要組分對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7和MDA-MB-231)、肺癌細(xì)胞(A549)、宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87、U172)以及人肝癌細(xì)胞的抗腫瘤活性[18-20]。本實(shí)驗(yàn)首次研究了蜂膠中11種主要組分對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109的毒性，發(fā)現(xiàn)CAPE和CABE對(duì)人食管癌細(xì)胞具有較好的抑制的功效，而且在有效的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的濃度范圍內(nèi)不會(huì)引起細(xì)胞的壞死，表明蜂膠中的這兩種酯類化合物在治療和預(yù)防食管癌方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 CAPE和CABE 上調(diào)Eca109細(xì)胞中ROS水平并降低線粒體膜電位Fig.6 CAPE and CABE obviously increased the levels of ROS and decreased mitochondrial membrane potential level in Eca109 cells注：A：CAPE和CABE對(duì)ROS影響及量化圖；B和C：CAPE和CABE對(duì)線粒體膜電位的影響及量化圖。Note:A:Quantification of CAPE and CABE on the levels of ROS;B and C:Effects of CAPE and CABE on mitochondrial membrane potential and quantification diagram.

活性氧(ROS)主要包括超氧陰離子、氫氧自由基和過(guò)氧化氫等。高水平的ROS對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著的損傷效應(yīng)，可導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化以及脂質(zhì)功能紊亂，從而引起細(xì)胞代謝、功能異常。大量研究表明，ROS可以作為第二信使參與包括凋亡在內(nèi)的細(xì)胞代謝調(diào)控，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。而且ROS與癌細(xì)胞的異常增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程密切相關(guān)。本研究表明，CAPE和CABE處理引起Eca109細(xì)胞中ROS水平顯著上調(diào)，并且促凋亡蛋白顯著上調(diào)，抑凋亡蛋白顯著下降，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤(rùn)都受到顯著抑制。據(jù)此，推測(cè)CAPE和CABE主要是通過(guò)ROS介導(dǎo)的線粒體內(nèi)源性途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，是一種食管上皮組織的惡性腫瘤，我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一。蜂膠是一種重要的天然產(chǎn)物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制功效。本研究進(jìn)一步證實(shí)蜂膠中的CAPE和CABE是兩種重要的抑制食管癌細(xì)胞增殖的天然產(chǎn)物。相比較于CABE， CAPE的研究非常多，其藥理學(xué)活性研究的非常深入[20]。CABE的研究相對(duì)較少，但通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CABE也是一種重要的抑制食管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)并誘導(dǎo)其凋亡的重要化合物，今后還需要進(jìn)一步深入研究CABE的藥理學(xué)活性和作用機(jī)理。

總之，盡管CAPE和CABE化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，但其對(duì)食管癌Eca109的抑制活性還是有差異，CAPE比CABE顯示出更好地促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡的活性。CAPE和CABE抑制食管癌Eca109細(xì)胞增殖主要是通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。CAPE和CABE是潛在的治療食管癌的化合物，值得深入研究。