云木香根莖中的倍半萜類成分研究

周 穎，楊 孔，吳 濤，李海舟，馮 陽(yáng)，許 敏

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院制藥工程技術(shù)中心，昆明 650500

肝癌是全世界第五大最常見的和高致死率的癌癥[1]。在肝癌中，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的85%～90%，是導(dǎo)致死亡的第二大常見原因，每年有70萬(wàn)人死亡。乙型肝炎(hepatitis B virus，HBV)或丙型肝炎(hepatitis C virus，HCV)病毒的慢性感染、慢性肝病、酗酒以及飲食致癌物質(zhì)，如黃曲霉毒素等是導(dǎo)致HCC的主要誘因[2]。據(jù)估計(jì)，亞洲和非洲的發(fā)病率最高[2]。目前沒有能有效治療HCC的藥物[2]。天然產(chǎn)物及其衍生物或是模擬天然產(chǎn)物及其藥效團(tuán)的藥物是抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉。其中，倍半萜類分子不僅骨架類型多樣，而且具有顯著的抗腫瘤活性[3]。因此，倍半萜的研究一直是天然產(chǎn)物化學(xué)非常重要和活躍的領(lǐng)域。

云木香(SaussurealappaC.B Clarke)隸屬于菊科(Compositae)風(fēng)毛菊屬(Saussurea)。原產(chǎn)地為印度東北部。上世紀(jì)四十年代中期逐步替代進(jìn)口，成為云南地道藥材之一，稱為“云木香”。云木香始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[4]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道云木香含有豐富的倍半萜(如愈創(chuàng)木烷型和吉瑪烷型倍半萜)類化合物。其中，去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯為其主要的倍半萜類成分。云木香具有抗病毒，抗炎，抗菌，抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)血管生成，解痙鎮(zhèn)痛，調(diào)理腸胃，抗胃潰瘍，利膽，調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，抗氧化，抗寄生蟲，昆蟲拒食以及調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等生物活性。其中，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯顯示顯著的抗乙肝病毒活性[5]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道木香烴內(nèi)酯以劑量和時(shí)間依賴性的方式有效抑制了肝癌細(xì)胞(HepG2)的增殖[6]。但是，未見開展云木香中倍半萜抑制肝癌細(xì)胞活性的系統(tǒng)研究。因此，基于我們長(zhǎng)期系統(tǒng)開展倍半萜類化學(xué)成分及其生物活性的研究[7-9]，本文對(duì)產(chǎn)自云南麗江云木香的根莖部位進(jìn)行了倍半萜類成分及其抑制肝癌細(xì)胞的研究，以期發(fā)現(xiàn)具有抗肝癌的天然活性分子。

1 材料與方法

1.1 材料

正相色譜采用的材料有80～100、200～300和500～800目硅膠(青島海洋化工廠)；反相材料采用的材料有：Diaion HP20SS(Mitsubishi Chemical Corportion,Tokyo Japan)；ODS-A(40～63 μm,日本)；MCI-gel-CHP-20P(75～150 μm,Mitsubishi Chemical Corportion,Tokyo Japan)。TLC采用G型(青島海洋化工廠)，顯色劑為10% H2SO4-EtOH溶液和碘化鉍鉀顯色劑，均勻噴灑后加熱至顯色。

Bruker DRX-600核磁共振波譜儀(Bruker BioSpin group，Germany)；Agilent 1260/6530 B液質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫公司，美國(guó))；分析型液相色譜儀Waters 2695/2996(Waters公司，美國(guó))；制備型液相色譜儀Waters 1525/2998(Waters公司，美國(guó))。

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；A-1000S真空泵(東京理化器械株式會(huì)社)；CA-1111冷卻水循環(huán)裝置(東京理化器械株式會(huì)社)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；SK-2200HP超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；ZF-1型三用紫外分析儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200 Pro，瑞士TECAN公司)。

實(shí)驗(yàn)所用云木香于2018年5月采于中國(guó)云南省麗江，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)吳之坤博士鑒定為云木香(SaussurealappaC.B Clarke)的干燥根。植物標(biāo)本保存于昆明理工大學(xué)生科樓天然藥物化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本編號(hào)為KUMST-BS-0007。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取和分離

取干燥的云木香根莖部分(119.0 kg)，粉碎之后用純甲醇在室溫下冷浸提取4次，每次用20 L甲醇，浸泡24 h，合并提取液，濃縮得到浸膏11.4 kg。浸膏加水稀釋至50 L，懸浮于水中，用乙酸乙酯萃取5次，合并濾液，減壓濃縮后得到乙酸乙酯萃取物4.5 kg(得率：39.5%)和水層4.6 kg(得率：40.4%)。

水層用適量水溶解，用大孔樹脂Diaion HP20SS(20.0 cm×80.0 cm)柱層析，以甲醇-水(0%、50%、55%、60%、70%、100%)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，然后經(jīng)薄層色譜TLC檢測(cè)，合并相同流分，將水層劃分為4個(gè)部分：ZY-1(69.4 g)、ZY-2(137.6 g)、ZY-3(171.6 g)和ZY-4(16.0 g)。ZY-3(171.6 g)用MCI反相樹脂(10.0 cm×36.0 cm)柱層析，以甲醇-水(0%→100%)梯度洗脫，然后經(jīng)薄層色譜TLC檢測(cè)，合并相同流分，得到7個(gè)部分：ZY3-1～ZY3-7。ZY3-3(49.5 g)用ODS-A(4.5 cm×40.0 cm)柱層析，以甲醇-水(35%→100%)梯度洗脫，然后經(jīng)薄層色譜TLC檢測(cè)，合并相同流分，得到6個(gè)部分：ZY3-3-1～ZY3-3-6。ZY3-3-3(16.5 g)分別用200～300目硅膠(5.0 cm×30.0 cm)柱層析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，然后經(jīng)硅膠柱(3.0 cm×18.0 cm)柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(35∶1→5∶1)梯度洗脫，然后經(jīng)薄層色譜TLC檢測(cè)，合并相同流分，得到16個(gè)部分：ZY3-3-3-1-1～ZY3-3-3-1-16。ZY3-3-3-1-6(63.3 mg)用硅膠(1.2 cm×20.0 cm)柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)等度洗脫，得到化合物2(4.5 mg)。ZY3-3-3-7(3.3 g)再分別用氨基硅膠(3.0 cm×30.0 cm)柱層析，以二氯甲烷-甲醇(10∶1→3∶1)梯度洗脫，ODS-A(3 cm×40.0 cm)柱層析，以甲醇-水(30%→100%)梯度洗脫，再通過HPLC半制備(20 %乙腈水)純化得到化合物8(8 mg)。ZY3-3-3-7-5-3(24.6 mg)，用200～300目硅膠(1.2 cm×30.0 cm)柱層析以二氯甲烷-甲醇(6∶1→5∶1)梯度洗脫，得到化合物9(8.0 mg)。ZY-3-3-3-1-6(63.3 mg)用硅膠(1.5 cm×15.0 cm)柱層析，以石油醚/乙酸乙酯(20∶1→4∶1)梯度洗脫，得到化合物6(8.7 mg)。ZY3-3-3-8(1.3 g)用ODS-A(3 cm×40.0 cm)柱層析，以甲醇-水(10%→100%)梯度洗脫，用200～300目硅膠(1.5 cm×25 cm)柱層析，以二氯甲烷-甲醇(13∶1→4∶1)梯度洗脫，再用薄層色譜制備得到化合物7(1.2 mg)。

ZY-4(16.0 g)經(jīng)200～300目硅膠柱(4.5 cm×40.0 cm)柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯(25∶1→5∶1)梯度洗脫，再經(jīng)200～300目硅膠柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫和羧基硅膠硅膠柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到化合物4(6.2 mg)、化合物5(2.2 mg)和化合物3(465.8 mg)。ZY4-4(5.2 g)反復(fù)經(jīng)200～300目硅膠柱柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫和羧基硅膠柱柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到化合物1(950.6 mg)。

1.2.2 細(xì)胞毒活性測(cè)試

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(DMEM)配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔3 000～15 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 (L，貼壁細(xì)胞提前12～24 h接種培養(yǎng)。待測(cè)化合物用DMSO溶解，30 μM為濃度初篩。37 ℃培養(yǎng)24 h后，貼壁細(xì)胞棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT(噻唑喃)溶液37 ℃孵育4 h，然后每孔加入150 μL DMSO(二甲基亞砜)避光震搖12 min，并且用多功能酶標(biāo)儀讀取于490 nm處檢測(cè)96孔板的OD值，記錄結(jié)果。順鉑(DDP)為陽(yáng)性對(duì)照化合物。最后按如下公式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(公式1)。

抑制率=[(空白組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組

OD值)/空白組平均OD值]×100%

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色晶體(CHCl3)；ESI-MS：m/z231 [M+H]+，253 [M+Na]+；分子式為C15H18O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.23(1H，d，J=3.5 Hz，H-13a)，5.50(1H，d，J=3.1 Hz，H-13b)，5.28(1H，d，J=2.1 Hz，H-15a)，5.08(1H，d，J=1.9 Hz，H-15b)，4.90(1H，s，H-14a)，4.82(1H，s，H-14b)，3.97(1H，t，J=9.3 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：30.3(C-1)，36.3(C-2)，149.2(C-3)，52.0(C-4)，85.3(C-5)，47.6(C-6)，30.9(C-7)，32.6(C-8)，139.7(C-9)，45.1(C-10)，151.3(C-11)，170.3(C-12)，120.3(C-13)，109.6(C-14)，112.6(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)照基本一致，故鑒定為去氫木香內(nèi)酯。

化合物2棕色油狀物(CHCl3)；ESI-MS：m/z271 [M+Na]+；分子式為C15H20O3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-15a)，5.31(1H，d，J=2.1 Hz，H-15b)，4.98(1H，s，H-14a)，4.94(1H，s，H-14b)，4.03(1H，t，J=9.7 Hz，H-1)，1.24(3H，d，J=7.0 Hz，Me-13)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：43.9(C-1)，39.2(C-2)，74.0(C-3)，153.7(C-4)，51.3(C-5)，84.2(C-6)，50.0(C-7)，32.8(C-8)，36.5(C-9)，149.3(C-10)，42.5(C-11)，179.0(C-12)，13.6(C-13)，111.5(C-14)，114.0(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)照基本一致，故鑒定為sausinlactone A。

化合物3白色晶體(CHCl3)；ESI-MS：m/z271 [M+K]+，487 [2M+Na]+；分子式為C15H20O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.27(1H，d，J=3.6 Hz，H-13a)，5.53(1H，d，J=3.6 Hz，H-13b)，4.85(1H，ddt，J=11.5，4.7，1.5 Hz，H-1)，4.74(1H，d，J=9.9 Hz，H-5)，4.58(1H，dd，J=9.8，8.8 Hz，H-6)，1.71(3H，s，Me-14)，1.43(3H，s，Me-15)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：127.0(C-1)，28.0(C-2)，41.0(C-3)，140.0(C-4)，127.0(C-5)，81.9(C-6)，50.4(C-7)，26.2(C-8)，39.4(C-9)，137.0(C-10)，141.5(C-11)，170.5(C-12)，119.7(C-13)，16.1(C-14)，17.4(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對(duì)照基本一致，故鑒定為木香烴內(nèi)脂。

化合物4白色晶體(CHCl3)；ESI-MS：m/z233 [M+H]+；分子式為C15H20O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.06(1H，d，J=3.2 Hz，H-13a)，5.39(1H，d，J=3.1 Hz，H-13b)，5.38(1H，s，H-3)，3.88(1H，t，J=11.0 Hz，H-6()，1.84(3H，s，Me-15)，0.92(3H，s，Me-14)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：39.9(C-1)，23.6(C-2)，123.2(C-3)，133.8(C-4)，51.9(C-5)，83.0(C-6)，51.9(C-7)，22.2(C-8)，38.5(C-9)，36.7(C-10)，140.1(C-11)，171.8(C-12)，117.2(C-13)，18.1(C-14)，24.4(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對(duì)照基本一致，故鑒定為α-環(huán)木香烴內(nèi)酯。

化合物 5白色針狀晶體(CHCl3)；ESI-MS：m/z233 [M+H]+；分子式為C15H22O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.31(1H，s，H-13a)，5.68(1H，s，H-13b)，4.71(1H，d，J=1.8 Hz，H-15a)，4.41(1H，d，J=1.8 Hz，H-15b)，0.73(3H，s，Me-14)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：42.00(C-1)，23.63(C-2)，41.21(C-3)，145.4(C-4)，50.0(C-5)，27.5(C-6)，39.5(C-7)，30.1(C-8)，37.0(C-9)，36.1(C-10)，150.9(C-11)，171.6(C-12)，124.9(C-13)，16.6(C-14)，105.7(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對(duì)照基本一致，故鑒定為β-木香酸。

化合物6白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z271 [M+Na]+；分子式為C15H20O3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.09(1H，d，J=3.2 Hz，H-13b)，5.42(1H，d，J=3.1 Hz，H-13a)，4.99(1H，d，J=1.0 Hz，H-15b)，4.86(1H，d，J=1.1 Hz，H-15a)，4.03(1H，t，J=10.9 Hz，H-6β)，3.53(1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-1α)，0.81(3H，s，Me-14)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：78.3(C-1)，31.4(C-2)，33.7(C-3)，142.7(C-4)，53.1(C-5)，79.8(C-6)，49.7(C-7)，21.6(C-8)，35.8(C-9)，43.1(C-10)，139.6(C-11)，171.0(C-12)，117.4(C-13)，11.8(C-14)，110.8(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照基本一致，故鑒定為reynosin。

化合物7白色晶體(CH3OH)；ESI-MS：m/z433 [M+Na]+；分子式為C21H30O8；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.14(1H，d，J=3.6 Hz，H-13a)，5.60(1H，d，J=3.3 Hz，H-13b)，4.59(1H，d，J=12.1，1.2 Hz，H-15a)，1.37(3H，s，Me-14)，4.26(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′-Glc)，3.94(1H，d，J=12.1 Hz，H-6a′-Glc)，3.83(1H，dd，J=11.9，1.6 Hz，H-6b′-Glc)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：127.7(C-1)，28.8(C-2)，42.2(C-3)，141.9(C-4)，131.3(C-5)，82.3(C-6)，51.9(C-7)，27.7(C-8)，36.7(C-9)，138.8(C-10)，142.3(C-11)，172.7(C-12)，120.4(C-13)，16.6(C-14)，68.6(C-15)，104.8(Glc C-1′)，75.3(Glc C-2′)，78.3(Glc C-4′)，71.8(Glc C-3′)，78.2(Glc C-5′)，62.9(Glc C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照基本一致，故鑒定為picriside B。

化合物8白色晶體(吡啶和CH3OH)；ESI-MS：m/z348 [M+H]+，370 [M+Na]+；分子式為C20H29NO4；1H NMR(600 MHz，Pyridine-d5)δ：4.46(2H，m，H-6 and H-1)，4.58(1H，d，J=9.9 Hz，H-5)，1.09(3H，s，Me-14)，1.36(3H，s，Me-15)；13C NMR(150 MHz，Pyridine-d5)δ：126.5(C-1)，28.3(C-2)，39.3(C-3)，139.7(C-4)，128.3(C-5)，81.4(C-6)，48.5(C-7)，26.2(C-8)，40.9(C-9)，137.4(C-10)，47.5(C-11)，178.1(C-12)，51.8(C-13)，16.9(C-14)，15.9(C-15)，176.5(C-1′)，67.6(C-2′)，29.3(C-3′)，24.1(C-4′)，54.3(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照基本一致，故鑒定為saussureamine A。

化合物9白色粉末(吡啶和CH3OH)；ESI-MS：m/z346 [M+H]+；分子式為C20H27NO4；1H NMR(600 MHz，Pyridine-d5)δ：3.75(1H，t，J=9.6 Hz，H-6)，2.62(1H，t，J=8.9 Hz，H-11)，3.15(1H，dd，J=13.3，5.5 Hz，H-13a)，2.91(1H，d，J=13.2 Hz，H-13b)，4.46(1H，br s，H-14a)，4.58(1H，s，H-14b)，4.86(1H，overlap，H-15a)，5.15(1H，overlap，H2O，H-15b)；13C NMR(150 MHz，Pyridine-d5)δ：46.6(C-1)，32.5(C-2)，29.9(C-3)，152.6(C-4)，52.1(C-5)，85.4(C-6)，44.0(C-7)，29.2(C-8)，38.1(C-9)，150.6(C-10)，47.0(C-11)，177.7(C-12)，51.9(C-13)，108.3(C-14)，110.9(C-15)，176.2(C-1′)，67.3(C-2′)，32.4(C-3′)，23.9(C-4′)，54.0(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照基本一致，故鑒定為saussureamine B。

圖1 云木香根莖中分離得到的化合物Fig.1 Chemical compounds from the S.lappa

2.2 抗腫瘤活性

本文測(cè)試了云木香根莖部分分離得到的倍半萜類化合物中不同結(jié)構(gòu)類型的主要成分，其分別為化合物1、3、4、6、8和9。研究結(jié)果提示，在30 μM上述化合物對(duì)肝癌細(xì)胞株(HepG2)具有弱的抑制活性。其中，化合物3木香烴內(nèi)酯對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞株具有一定的細(xì)胞毒活性，其抑制率為60%(如表1所示)。

表1 化合物對(duì)HepG2的細(xì)胞毒活性Table 1 Cytotoxic activity on HepG2 cells

3 討論與結(jié)論

天然產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)多樣性是尋找新藥目標(biāo)化學(xué)實(shí)體的源泉，有多達(dá)40%的治療藥物來源于傳統(tǒng)藥用植物等天然資源[18]。其中，倍半萜分子是一類廣泛分布于生物體中骨架類型最多樣最復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，迄今為止已發(fā)現(xiàn)幾千種倍半萜類化合物，涉及200多種骨架，無(wú)論是在數(shù)量上還是在骨架類型上均居萜類成分之首[19]。為此，倍半萜的研究一直是天然產(chǎn)物化學(xué)非常重要和活躍的領(lǐng)域。多數(shù)倍半萜分子不僅結(jié)構(gòu)新穎而且具有顯著的細(xì)胞毒活性。云木香為菊科風(fēng)毛菊屬植物，富含倍半萜類成分。前期研究發(fā)現(xiàn)其主要被倍半萜類成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯是云木香中的主要活性成分之一，具有顯著抗乙型肝炎病毒等生物活性[20]。此外，也有報(bào)道木香烴內(nèi)酯對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞(U2OS)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、膀胱癌細(xì)胞(T24)、白血病細(xì)胞(HL-60)、宮頸癌細(xì)胞(Hela)和肝癌細(xì)胞(HepG2)等多種癌癥細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用[6]。但是，未見云木香中其他倍半萜類成分抗肝癌細(xì)胞增殖的研究報(bào)道。本論文從云南省麗江產(chǎn)云木香根莖部位分離鑒定了9個(gè)倍半萜類成分，骨架類型涉及愈創(chuàng)木烷型3個(gè)(化合物1、2和9)、桉葉烷型3個(gè)(化合物4～6)和吉瑪烷型3個(gè)(化合物3、7和8)。其中，化合物8和9為較少見的倍半萜和氨基酸的雜合體。細(xì)胞毒活性測(cè)試提示化合物1、3、4、6、8和9在30 μM濃度時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞株(HepG2)具有弱的細(xì)胞毒活性。其中，化合物木香烴內(nèi)酯(3)的抑制率為60%，該研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[6]。此外，我們的研究結(jié)果提示，云木香中分離鑒定的倍半萜類分子中吉瑪烷型類分子比愈創(chuàng)木烷型和桉葉烷型倍半萜類分子顯示較強(qiáng)的肝癌細(xì)胞抑制活性。因此，非常有必要進(jìn)一步對(duì)云木香中的吉瑪烷型類的倍半萜類分子開展研究，為其在抑制肝癌細(xì)胞活性的構(gòu)型關(guān)系研究提供參考，也為云木香藥材的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

致謝:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)試中心和昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心測(cè)試所有圖譜。