枸杞芽葉有效成分對(duì)急性酒精性肝損傷保護(hù)作用研究

欒 倩，樊 毅，張 淼，張?jiān)獜?qiáng)，許露露，哈成勇*，張玉彬*

1 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198；2 銀川中科元昊科技有限公司，銀川 750000；3 江蘇省人民醫(yī)院浦口分院，南京 211800

我國是肝病大國，隨著新生兒乙肝疫苗的廣泛使用，病毒性肝病正在逐年減少，但隨著人們生活方式的改變，非病毒性肝病正在逐年增加。非病毒性肝病主要包括酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝、非酒精性肝病、藥源性肝病、肝硬化和肝癌等[1]，嚴(yán)重影響著人類的健康。ALD是非病毒性肝病的主要代表，也是其他肝病的重要誘因，其發(fā)病率逐年增加，并趨向于年輕化發(fā)展。ALD初期是長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟病變，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且研究不夠透徹。目前對(duì)于ALD的治療缺少有效藥物，迫切需要研發(fā)新的治療藥物[2,3]。

《本草綱目》記載“春采枸杞葉，名天精草”。天精草具有養(yǎng)肝明目、補(bǔ)虛益精之功效。枸杞是傳統(tǒng)中藥，具有護(hù)肝明目作用。多年來，人們對(duì)枸杞果實(shí)的研究較多[4]，但對(duì)枸杞葉有效成分用于治療ALD的研究報(bào)道相對(duì)較少。本論文以枸杞芽葉為原料，從中分離純化制備得到枸杞芽葉有效成分(AILBL)，研究發(fā)現(xiàn)其有效成分主要含有一組以黃酮類物質(zhì)主要成分的抗氧化性物質(zhì)[5]。ALD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)“二次打擊”學(xué)說即氧化應(yīng)激和炎癥性反應(yīng)，其中氧化應(yīng)激是ALD發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素[6]，因此，含有抗氧化性活性成分的枸杞葉有效成分是開發(fā)臨床治療ALD的天然藥物資源。本研究旨在探索枸杞芽葉有效成分對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及可能的抗氧化作用機(jī)制，為后期開發(fā)具有防治酒精性肝損傷的功能性食品添加劑或保健品提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

8周齡雄性ICR小鼠，購于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(合格證號(hào)：NO.201928893，許可證號(hào)：SYXK (蘇)2018-0019)，體重20±2 g，于12小時(shí)晝夜交替、通風(fēng)、恒溫(25 ± 2 ℃)、恒濕(50%～60%)的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，自由飲水，飼以標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料(購于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng))。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按江蘇省和中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與操作要求進(jìn)行。

人肝癌HepG2細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑

枸杞芽葉由寧夏杞芽食品科技有限公司提供，并經(jīng)中國藥科大學(xué)生藥學(xué)張勉教授鑒定；無水乙醇和石油醚(上海Titanic科技有限公司)；大孔樹脂HP-20(上海摩速科學(xué)器材有限公司)；DPPH(上海源葉生物科技有限公司)；ABTS法檢測(cè)總抗氧化能力試劑盒、ALT和AST檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；DCFH-DA、DAPI(Sigma)；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(上海翊圣生物科技有限)；抗CYP2E1抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高速多功能粉碎機(jī)(永康市鑫之鴻電器有限公司)；AF-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(江蘇東臺(tái)電器廠)；磁力攪拌水浴鍋HCJ-4E(常州朗越儀器制造有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(太倉精宏儀器設(shè)備有限公司)；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；分析天平BS 124S(天津市天馬儀器廠)；電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；752 UV/Vis紫外-可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(無錫市金利大紙塑制品有限公司)；酶標(biāo)儀(美國BioRad)；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技)；生物安全柜(賽默飛世爾科技)；電泳槽(上海天能科技有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 枸杞芽葉粗提液(crude AILBL)的制備[5]

將枸杞芽葉用高速多功能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，采用乙醇回流提取，提取條件為：乙醇濃度78%，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度75 °C、料液比1∶30，過濾得上清液，將液體靜置于4 °C冰箱12 h后，再過濾，將上清液減壓濃縮至無醇味，再將得到的濃縮液用石油醚萃取脫色，最后將水溶相減壓濃縮至無石油醚味，即得枸杞芽葉粗提液(crude AILBL)。

2.2 枸杞芽葉有效成分(AILBL)的制備[5]

將“2.1”中所得的枸杞芽葉粗提液用HP-20大孔樹脂進(jìn)行純化，純化條件為：上樣濃度為9.056 mg/mL，上樣流速為2.0 mL/min，上樣體積為8 BV，60%乙醇溶液為洗脫液，洗脫流速為3 mL/min，洗脫劑用量為3 BV。將純化得到的得液體減壓濃縮、凍干，即得枸杞芽葉有效成分(AILBL)。

2.3 ABTS法檢測(cè)總抗氧化能力

采用ABTS法，以Trolox溶液、蘆丁溶液為參考標(biāo)準(zhǔn)，體外檢測(cè)AILBL的抗氧化活性。取一塊96孔板，分別設(shè)定空白孔、對(duì)照孔、Trolox標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)孔、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)孔和樣品檢測(cè)孔。按照ABTS試劑盒的操作方法，取10 μL不同濃度的Trolox溶液、蘆丁溶液和AILBL樣品溶液于96孔板，以10 μL蒸餾水為空白，最后每孔分別加入20 μL的ABTS應(yīng)用液和170 μL的ABTS工作液，混勻，室溫反應(yīng)6 min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405 nm下檢測(cè)各孔吸光度值。ABTS+·清除能力的計(jì)算公式如下。

ABTS+·清除能力= [1-(OD檢測(cè)-OD對(duì)照)/

OD空白]×100%

式中OD檢測(cè)為不同濃度的Trolox溶液、蘆丁溶液及樣品溶液測(cè)定的吸光值；OD對(duì)照為蒸餾水代替ABTS工作液加入測(cè)得的吸光值；OD空白為水代替樣品溶液測(cè)得的吸光值。

2.4 DPPH法檢測(cè)AILBL總抗氧化能力

采用DPPH法[7]，以Trolox溶液、蘆丁溶液為參考標(biāo)準(zhǔn)，體外檢測(cè)AILBL的抗氧化活性。精密配置1 mM濃度的DPPH溶液作為儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)前將DPPH儲(chǔ)備液稀釋10倍至0.1 mM，得到DPPH工作液；取100 μL蒸餾水于空白孔中，取100 μL不同濃度的Trolox溶液和蘆丁溶液于陽性對(duì)照孔中，取100 μL不同濃度的AILBL樣品溶液于檢測(cè)孔中，最后加入DPPH工作液100 μL，混勻，室溫避光反應(yīng)20 min，酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值。DPPH·清除能力的計(jì)算公式如下。

DPPH·清除能力=[1-(OD檢測(cè)-OD對(duì)照)/OD空白]

×100%

式中OD檢測(cè)為不同濃度的Trolox溶液、蘆丁溶液及樣品溶液測(cè)定的吸光值，OD對(duì)照為蒸餾水代替DPPH工作液加入測(cè)得的吸光值，OD空白為水代替樣品溶液測(cè)得的吸光值。

2.5 動(dòng)物分組、模型建立及給藥

取雄性ICR小鼠48只，體重20±2 g，適應(yīng)環(huán)境3天后，隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為正常對(duì)照組、酒精模型組(6 g/kg，i.g.)、陽性藥對(duì)照組水飛薊素(silymarin)(200 mg/kg，i.g.)、AILBL低、中、高劑量組(30、100、300 mg/kg，i.g.)。各給藥組灌胃給藥每天1次，連續(xù)1周，給藥體積為15 mL/kg，對(duì)照組和模型組灌胃給予相同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠于末次給藥結(jié)束后12 h，給予小鼠灌胃6 g/kg的酒精，間隔12 h灌胃一次，共3次。

2.6 小鼠肝臟H&E染色和血清生化指標(biāo)測(cè)定

末次灌胃酒精6 h后處理小鼠，眼眶取血，靜置30 min，6 000 rpm離心10 min，常規(guī)分離血清。脫頸椎處死小鼠，迅速取出肝組織稱重，并在左肝葉同一部位，同時(shí)取小塊肝組織以10%福爾馬林溶液固定，送至武漢塞維爾生物有限公司做常規(guī)石蠟包埋、切片以及H&E染色，觀察肝組織病理改變。定量稱取肝組織置于0.9%生理鹽水中勻漿，制備10%肝臟勻漿液，離心后收集上清。按試劑盒說明書要求，用酶標(biāo)儀法分別測(cè)定血清中ALT、AST、肝組織中MDA和GSH含量。

2.7 免疫組化檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白

將制備完成的切片按照脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、封片的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行免疫組化染色，通過軟件分析陽性反應(yīng)物相對(duì)含量，檢測(cè)氧化應(yīng)急相關(guān)蛋白CYP2E1、HIF-1α、iNOS的變化。

2.8 體外ROS測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，給藥組用2 mL含不同濃度AILBL(0、20、40 μg/mL)的培養(yǎng)基預(yù)孵育6 h，空白對(duì)照組和乙醇模型組加入含等體積的空白溶劑的培養(yǎng)基，然后模型組和給藥組加入46.7 μL無菌乙醇(終濃度400 mM)，空白組加入等體積的無菌水，處理24 h。棄上清，PBS洗三次，加入DCFH-DA探針工作液，37 ℃避光溫育30 min后，PBS再洗兩次。加入DAPI探針工作液，37 ℃避光溫育15 min后，PBS洗三次后，10%多聚甲醛避光固定10 min，熒光顯微鏡下觀察情況，并拍照。

2.9 Westerm blot檢測(cè)CYP2E1表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，給藥組用2 mL含不同濃度AILBL(0、20、40 μg/mL)的培養(yǎng)基預(yù)孵育6 h，空白對(duì)照組和乙醇模型組加入含等體積的空白溶劑的培養(yǎng)基，然后模型組和給藥組加入46.7 μL無菌乙醇(終濃度400 mM)，空白組加入等體積的無菌水，處理24 h。收集細(xì)胞，用冰冷的RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，超聲裂解后于4 ℃、12 000 g下離心20 min，吸取上清以BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣量為20 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。最后，用ECL化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行發(fā)光顯影，用Image J軟件對(duì)所得圖像進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶的半定量分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文均采用GraphPad Prism5.01軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組之間的數(shù)據(jù)應(yīng)用One-way ANOVA對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P<0.01表示有顯著性差異；P<0.001表示有極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 AILBL的體外抗氧化能力

經(jīng)化學(xué)法和HPLC及LC-MS分析檢測(cè)表明本實(shí)驗(yàn)研究所用枸杞葉有效成分AILBL是一組以黃酮類化合物為主要成分的天然抗氧化物[5]。采用ABTS法檢測(cè)總抗氧化的結(jié)果如圖1所示，隨著樣品濃度的增加，樣品對(duì)ABTS+·的清除率不斷增加，最后趨于平緩。經(jīng)HP-20大孔樹脂純化后的枸杞芽葉有效成分(AILBL)清除ABTS+·的能力顯著高于枸杞芽葉有效成分粗提液(Crude AILBL)(P<0.001)，在1 mg/mL時(shí)。通過GraphPad Prism軟件計(jì)算可知Trolox和AILBL的ABTS+·半數(shù)清除濃度EC50分別是0.5679和0.6554mg/mL，AILBL粗提液和蘆丁的ABTS+·半數(shù)清除濃度EC50均大于2 mg/mL，由此可知四種物質(zhì)清除ABTS+·的能力順序?yàn)椋篢rolox>AILBL > AILBL粗提液>蘆丁。

圖1 不同濃度樣品對(duì)ABTS+·清除能力Fig.1 ABTS+· scavenging ability in different concentrations of samples

DPPH法檢測(cè)總抗氧化的結(jié)果如圖2所示，經(jīng)HP-20大孔樹脂純化后的AILBL清除DPPH·能力顯著高于AILBL粗提液(P<0.001)。隨著樣品濃度的增加，樣品對(duì)DPPH·清除率不斷增加，最后趨于平緩。通過GraphPad Prism軟件計(jì)算可知純化后的AILBL、AILBL粗提液、Trolox以及蘆丁的DPPH·半數(shù)清除濃度EC50分別是0.236 6、0.870 8、0.715 4、0.455 2 mg/mL，由此可知四種物質(zhì)清除DPPH·的能力順序?yàn)椋篈ILBL >蘆丁>Trolox >AILBL粗提液。

3.2 AILBL對(duì)急性酒精性損傷肝功能的保護(hù)作用

與正常對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠血清中ALT和AST活性極顯著增加(P<0.001)。與酒精模型組相比，陽性藥對(duì)照組和AILBL給藥組均能不同程度地降低小鼠血清中ALT和AST活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且AILBL效果呈現(xiàn)劑量依賴性降低，其中AILBL高劑量組降低效果最為明顯(P<0.001)，ALT和AST分別降低了35.08%和27.98%(如表1所示)?？梢?，AILBL通過降低急性酒精性肝損傷引起的小鼠血清中ALT和AST活性增加進(jìn)而起到保護(hù)肝功能的作用。

圖2 不同濃度樣品對(duì)DPPH·清除能力Fig.2 DPPH· scavenging ability in different concentrations of samples

表1 AILBL對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響Table 1 Effects of AILBL on serum ALT and AST in mice with alcoholic liver injury

3.3 AILBL對(duì)酒精性肝損傷小鼠氧化損傷的保護(hù)作用

與正常對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠肝臟MDA含量升高2.42倍、GSH含量降低了48.17%(P<0.001)。與酒精模型組相比，陽性藥對(duì)照組和AILBL給藥組均能不同程度地降低小鼠肝臟MDA含量和升高小鼠肝臟中GSH含量，且AILBL效果呈現(xiàn)劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如表2所示)。由此可見，AILBL能顯著降低酒精性肝損傷小鼠的MDA水平，促進(jìn)GSH再生，增強(qiáng)肝臟自由基的清除能力，從而減少由于體內(nèi)過氧化產(chǎn)物堆積造成對(duì)肝臟的“二次打擊”損傷，保護(hù)肝臟的功能[8]。

表2 AILBL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA和GSH含量的影響Table 2 Effects of AILBL on hepatic MDA and GSH in mice with alcoholic

3.4 AILBL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響

如圖3所示，正常對(duì)照組(圖3A)小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞未發(fā)生脂肪變性。酒精模型組(圖3B)肝形態(tài)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞間排列紊亂，細(xì)胞間的界限模糊不清，肝細(xì)胞腫大，細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙變大，胞漿呈空泡狀，脂滴累積增多，發(fā)生明顯的氣球樣脂肪變性。陽性藥對(duì)照組(圖3C)、AILBL低劑量組(圖3D)、AILBL中劑量組(圖3E)和AILBL高劑量組(圖3F)均能不同程度地減少胞漿內(nèi)的空泡與脂滴，氣球樣脂肪變性得到緩解。其中AILBL高劑量組恢復(fù)效果最為明顯，幾乎恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。以上結(jié)果提示，AILBL可以有效減輕乙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠肝臟脂肪病變。

圖3 AILBL對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(×400)Fig.3 Effect of AILBL on hepatic morphology in mice with alcoholic liver injury (×400)注：A：正常對(duì)照組；B：酒精模型組；C：陽性藥對(duì)照組；D：AILBL低劑量組；E：AILBL中劑量組；F：AILBL高劑量組；紅色箭頭：細(xì)胞核固縮；黑色箭頭：脂肪空泡。Note:A:Control;B:Ethanol;C:Silymarin;D:L-AILBL;E:M-AILBL;F:H-AILBL;Red arrow:Nuclear pyknosis;Black arrow:Fat vacuole.

圖4 AILBL對(duì)酒精性肝損傷中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響(×200)Fig.4 Effect of AILBL on oxidative stress-related proteins in alcoholic liver injury (×200)注：A：正常對(duì)照組；B：酒精模型組；C：陽性藥對(duì)照組；D：AILBL低劑量組；E：AILBL中劑量組；F：AILBL高劑量組。Note:A:Control;B:Ethanol;C:Silymarin;D:L-AILBL;E:M-AILBL;F:H-AILBL.

3.5 AILBL動(dòng)物水平的分子機(jī)制

氧化應(yīng)激是酒精性肝病發(fā)生的重要因素之一，CYP2E1作為一種重要的肝代謝酶，能誘發(fā)過量ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。圖4表明，酒精刺激后，肝臟中CYP2E1表達(dá)明顯增多，而陽性藥水飛薊素和AILBL給藥組均能不同程度抑制酒精誘發(fā)的CYP2E1升高。AILBL給藥組中高劑量300 mg/kg的效果最好，顯著的降低CYP2E1的表達(dá)。同時(shí)，AILBL能抑制氧化應(yīng)激相關(guān)的缺氧蛋白HIF-1α和iNOS的蛋白表達(dá)。

3.6 細(xì)胞水平的分子機(jī)制研究

如圖5所示，與正常對(duì)照組相比，400 mM乙醇刺激HepG2細(xì)胞24 h后，ROS明顯升高，而AILBL(20、40 μg/mL)預(yù)給藥6 h能顯著減少ROS的累積，這表明AILBL能有效緩解乙醇刺激引起的氧化應(yīng)激。同時(shí)，AILBL(20、40 μg/mL)預(yù)防給藥能明顯抑制乙醇刺激誘發(fā)的CYP2E1高表達(dá)(圖6)。由此可見，AILBL能通過抑制CYP2E1的表達(dá)和ROS的累積來減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

圖5 AILBL減少乙醇刺激HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的過多ROS(×200)Fig.5 AILBL reduced the excessive production of ROS stimulated by ethanol in HepG2 cell (×200)注：A：正常對(duì)照組；B：酒精模型組；C：AILBL低劑量組-20；D：AILBL高劑量組-40。Note:A:Control;B:Ethanol;C:L-AILBL-20;D:H-AILBL-40.

圖6 AILBL降低乙醇刺激誘發(fā)的CYP2E1升高Fig.6 AILBL decreased the over expression of CYP2E1 induced by ethanol

4 討論

枸杞是中華傳統(tǒng)經(jīng)典中藥之一，在詩經(jīng)、神農(nóng)本草經(jīng)、藥性論中經(jīng)常出現(xiàn)。研究表明，枸杞具有潤肺、益氣、護(hù)肝明目等多種藥學(xué)功效[5,9,10]。人們較多的研究側(cè)重于枸杞子，而對(duì)枸杞芽葉的研究相對(duì)較少。枸杞子富含枸杞多糖和黃酮類等抗氧化物質(zhì)，能增強(qiáng)機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶能力、抗疲勞能力和免疫力，并能有效清除機(jī)體自由基、提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力，保護(hù)肝、腎等臟器，從生理生化學(xué)等方面對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用[4]。相對(duì)于枸杞子，我們的研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉中的黃酮類化合物含量比枸杞子更高[5]，在體外具有顯著的清除自由基的能力，對(duì)ALD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有很好的防治作用，未來可研制為藥品或保健品，用于ALD的防治。

大約有20%的人在過量或長(zhǎng)期飲酒后出現(xiàn)肝損傷，酒精代謝過程中活性氧自由基生成過剩和脂質(zhì)代謝紊亂是誘發(fā)細(xì)胞損傷與凋亡的重要因素。當(dāng)肝臟細(xì)胞及線粒體遭遇活性氧自由基攻擊時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH等還原性大分子蛋白質(zhì)急劇減少、DNA斷裂、線粒體及細(xì)胞膜破損[2,8]，細(xì)胞中ALT和AST釋放進(jìn)入血液，因此常用血清ALT和AST含量評(píng)價(jià)肝臟損傷和肝功能是否正常。本實(shí)驗(yàn)通過連續(xù)三次酒精灌胃建立急性酒精性肝損傷模型[3]，本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)給予酒精灌胃的模型組小鼠血清ALT和AST均超出正常水平，而給予陽性藥和不同濃度AILBL預(yù)防治療組小鼠血清中ALT和AST顯著下降，且給藥組小鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)得到良好改善，減少了氧化應(yīng)激關(guān)鍵蛋白CYP2E1的表達(dá)，表明AILBL對(duì)急性酒精性肝損傷具有很好的保護(hù)作用。

AILBL中富含黃酮等多種抗氧化物質(zhì)[12]，是其發(fā)揮抗氧化、保護(hù)細(xì)胞氧化損傷的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[5,13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，AILBL能顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠的MDA水平，促進(jìn)GSH再生，增強(qiáng)肝臟自由基的清除能力，從而減少由于體內(nèi)過氧化產(chǎn)物堆積造成對(duì)肝臟的“二次打擊”損傷，具有顯著的護(hù)肝功能。與此同時(shí)，AILBL在體外通過抑制CYP2E1表達(dá)顯著減少乙醇誘導(dǎo)的ROS累積。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室通過提取枸杞芽葉中的有效成分并研究其對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用發(fā)現(xiàn)，AILBL能夠通清除肝細(xì)胞中MDA，提高GSH水平，抑制肝細(xì)胞中CYP2E1的表達(dá)，改善酒精引起的肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化和炎癥，從而達(dá)到護(hù)肝的功效。本研究將會(huì)使枸杞葉有效成分成為預(yù)防治療ALD等肝病的有效藥物或保健品，為我國中藥現(xiàn)代化研究做出新貢獻(xiàn)。