冰凍核酸標(biāo)本質(zhì)量控制對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響①

劉 靜,陳 巖

(佳木斯市中心血站 檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154002)

核酸檢測(cè)技術(shù)(nu-cleic acid amplification testing,NAT)是一新興的血液傳染病檢測(cè)方法，能顯著縮短血液感染病毒的“窗口期”，降低經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)[1]。隨著血站血液篩查實(shí)驗(yàn)室將血液核酸檢測(cè)技術(shù)的引入，核酸檢測(cè)已經(jīng)成為確保血液安全性的重要技術(shù)之一。分析前的質(zhì)量控制包括病人準(zhǔn)備、標(biāo)本采集儲(chǔ)存及運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程[2]。做好核酸檢測(cè)分析前的質(zhì)量控制才能使核酸檢測(cè)更安全可靠。我市中心血站是中小型血站，標(biāo)本量小，實(shí)驗(yàn)室周末不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，周五周六采集的標(biāo)本需凍存，待周一酶免檢測(cè)完成后，周二進(jìn)行核酸檢測(cè)。另外我站還承擔(dān)3個(gè)中心血庫(kù)的核酸集中檢測(cè)工作，3個(gè)血庫(kù)路途遙遠(yuǎn)，不能每日及時(shí)送檢至本站，部分核酸標(biāo)本需要冰凍，所以做好冰凍核酸標(biāo)本的質(zhì)量控制尤為重要。本血站在做好冰凍核酸標(biāo)本的質(zhì)量控制下，對(duì)冰凍核酸樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了綜合分析評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

2016-01～2017-12獻(xiàn)血者血液核酸檢測(cè)標(biāo)本。2016～2017年佳木斯市中心血站共檢測(cè)無(wú)償獻(xiàn)血者核酸標(biāo)本47753人次，共拆分64次，取512份標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組的512份核酸標(biāo)本拆分實(shí)驗(yàn)結(jié)束后凍存在-30℃以下72h以上，作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前1h放置室溫平衡、復(fù)融進(jìn)行核酸檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 儀器: 浩源核酸匯集提取系統(tǒng)(ChiTas BSS1200)；ABI7500擴(kuò)增儀；松下醫(yī)用低溫箱(MDF-U5412N)。

1.2.2 試劑: 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人類(lèi)免疫缺陷病毒(1型)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光法)試劑盒；HBV DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、HCV RNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、HIV RNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(康徹斯坦生物)。

1.3 檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)組：對(duì)日常ELISA檢測(cè)陰性的標(biāo)本進(jìn)行核酸8人份混合樣本模式進(jìn)行檢測(cè)，若混樣檢測(cè)反應(yīng)性，再進(jìn)行拆分，即核酸單檢，單檢呈反應(yīng)性判斷為NAT陽(yáng)性，單檢呈無(wú)反應(yīng)性判斷為陰性?；鞓訖z測(cè)反應(yīng)性，再進(jìn)行拆分的標(biāo)本入組。拆分的標(biāo)本號(hào)及檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行記錄。

對(duì)照組：將實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)本凍存72h以上進(jìn)行單檢，單檢呈反應(yīng)性判斷為NAT陽(yáng)性，單檢呈無(wú)反應(yīng)性判斷為陰性。標(biāo)本號(hào)及檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行記錄。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的陰陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)本號(hào)，檢出的陰陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)本號(hào)一致，無(wú)差異 。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組陽(yáng)性結(jié)果比較

2016～2017年混樣檢測(cè)反應(yīng)性，再進(jìn)行拆分的標(biāo)本凍存后進(jìn)行檢測(cè)，檢出的陽(yáng)性標(biāo)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2016～2017年實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)

2.2 NAT檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2016～2017年佳木斯市中心血站共檢測(cè)無(wú)償獻(xiàn)血者核酸標(biāo)本47753人次，共拆分64次，拆分率為0.84%，拆分陽(yáng)性數(shù)為26人次，其中25人次是HBV陽(yáng)性，1人次是HIV陽(yáng)性。陽(yáng)性率為0.054%。2016年共拆分38次，拆分的樣本數(shù)為304人次，檢出的陽(yáng)性樣本15人次。2017年共拆分26次，拆分的樣本數(shù)為208人次，檢出的陽(yáng)性樣本11人次。核酸陽(yáng)性標(biāo)本的檢出率符合我國(guó)東部地區(qū)采供血機(jī)構(gòu)的流行病學(xué)趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 2016～2017年無(wú)償獻(xiàn)血者核酸標(biāo)本檢測(cè)

3 討論

做好冰凍的核酸標(biāo)本的檢測(cè)應(yīng)對(duì)標(biāo)本從兩方面進(jìn)行質(zhì)量控制。第一，核酸標(biāo)本凍存前應(yīng)觀察標(biāo)本是否存在溶血、脂血、凝塊。因?yàn)槿苎臉?biāo)本中含有血紅素，血紅素可通過(guò)其卟啉環(huán)與Taq酶的不可逆結(jié)合而抑制Taq酶活性，可影響PCR擴(kuò)增檢測(cè)[3]。脂血的標(biāo)本在加樣過(guò)程中干擾加樣針對(duì)液面的探測(cè)，容易加樣不足量。而且對(duì)熒光的屏蔽和吸收作用有干擾，影響檢測(cè)結(jié)果。凝塊的標(biāo)本易在檢測(cè)加樣過(guò)程中吸到凝塊，導(dǎo)致加樣量不足。而且在加樣過(guò)程中會(huì)形成拖帶、拉絲現(xiàn)象，造成標(biāo)本間的污染；而且有的加樣儀器當(dāng)監(jiān)測(cè)到標(biāo)本有異常情況時(shí)，它會(huì)自動(dòng)終止實(shí)驗(yàn)，造成很大的浪費(fèi)[4]。上述的標(biāo)本不適合做核酸檢測(cè)，更不適合凍存后進(jìn)行核酸檢測(cè)。第二，凍存后的核酸標(biāo)本在檢測(cè)前的處理。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將核酸標(biāo)本從冰箱取出，置18～25℃平衡室溫1h后顛倒混勻，隨即進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)楹怂崞卧谘獫{中向下沉降，易吸附在試管壁、分離膠上面，故顛倒混勻這一操作步驟對(duì)檢出率影響很大。此外還應(yīng)該注意，DNA樣本切忌反復(fù)凍融，若DNA樣本長(zhǎng)期存放于-20℃環(huán)境或?qū)嶒?yàn)過(guò)程中反復(fù)多次凍融，則易發(fā)生降解[5]；避免冰凍標(biāo)本二次離心，會(huì)使凍融后破裂溢出的細(xì)胞液從分離膠下層進(jìn)入到分離膠上層，不僅稀釋標(biāo)本濃度，還會(huì)抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)。

綜上，做好冰凍核酸標(biāo)本質(zhì)量的控制，才能保證冰凍核酸標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的安全可靠。對(duì)于一份核酸樣本檢測(cè)結(jié)果的判斷，還需要我們多方面因素考慮，不可大意。目前核酸項(xiàng)目對(duì)于采供血機(jī)構(gòu)開(kāi)展的時(shí)間并不長(zhǎng)，我們還需探索發(fā)現(xiàn)，完善血液篩查工作。