細葉小檗葉中總黃酮含量測定①

吳莉莉，白術杰，王書紅，張羽男

(佳木斯大學藥學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

細葉小檗(Berberis poiretii Schneid)是小檗科小檗屬的植物。別名三顆針、針雀，分布于俄羅斯、朝鮮、蒙古以及中國大陸的黑龍江、吉林、山西等地，生長于海拔600～2,300米的地區(qū)，目前尚未由人工引種栽培。根、根皮中含有多種生物堿，主要為小檗堿，功效是清熱燥濕、瀉火解毒、健胃。用治療吐瀉、痢疾、咳嗽、膽囊炎、目赤、口瘡、無名腫毒、濕疹、燒、燙傷、高血壓癥。但細葉小檗葉的總黃酮含量測定未見報道?，F(xiàn)對東北地區(qū)的細葉小檗葉的總黃酮進行提取及含量測定，為細葉小檗葉資源的合理開發(fā)和利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

樣品采自黑龍江省伊春市嘉蔭縣山區(qū)，由佳木斯大學藥學院宗希明老師鑒定為細葉小檗葉。

1.2 儀器與試劑

UV-757CRT型紫外可見分光光度計[1](上海精科學儀器有限公司)，RE-52A型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)，UV-1型三用紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠)，KQ 5200型超聲波清洗器(江蘇昆山儀器廠)，101-Ⅲ型電熱鼓風恒溫干燥箱(江蘇大地自動化儀器廠)，98-1-B 型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

蘆丁標準品為中國藥品生物制品鑒定所購買，所用硅膠G為青島海洋化工集團公司生產(chǎn)，氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鋁、鎂粉、甲醇、95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、鹽酸、濃硫酸等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃酮檢識試驗

在進行含量測定之前，對細葉小檗葉采用試管試驗、紙色譜、薄層色譜進行了鹽酸鎂粉反應、三氯化鋁反應、乙酸鎂反應等黃酮檢識試驗，見表1。

表1 樣品的黃酮檢識反應結果

細葉小檗葉提取液的黃酮檢測結果均為正反應，實驗結果顯示該植物中含有黃酮類化合物。

2.2 最大吸收波長的選擇

精密稱取 120 ℃干燥至恒重的蘆丁[2]對照品19.03mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇完全溶解并定容，蘆丁對照品濃度為，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL(標號為標1～7)的容量瓶中，以甲醇為溶劑，亞硝酸鈉、硝酸鋁[3]和氫氧化鈉為顯示劑，分別以吸光度(A)為縱坐標，波長(λ)為橫坐標作圖，得到吸收曲線，細葉小檗葉和蘆丁標準品的吸收曲線 ，均在510nm處有一強吸收最大吸收波，因此選擇510nm為測定波長。

2.3 蘆丁標準曲線的制備

將已制備好的7個蘆丁對照品溶液置于紫外分光光度計中，在200～800nm(間隔1nm)下全波長掃描[4]，樣品檢測波長在510nm處分別測定吸光度；以吸光度值A為縱坐標，對照品溶液質量濃度 C 為橫坐標，得到回歸方程和相關系數(shù)繪制標準曲線。結果顯示蘆丁濃度在0.0156～0.0468mg/mL間具有良好的線性關系，回歸方程為C=0.0471A-0.0128，r=0.9988，得到蘆丁的標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁的標準曲線

2.4 提取工藝研究

取干燥細葉小檗葉粗粉60g平均分成2份，分別用10倍量的65%的乙醇[5]和95%的乙醇[6]浸泡1h超聲(功率 250 W ，頻率40kHz)提取法[7]提取2次，時間30min，溫度60℃合并提取液，過濾，濾液回收乙醇并濃縮為2份墨綠色浸膏。分別將浸膏加水體積比1：1.5分散后分別用石油醚、氯仿、乙酸乙脂、正丁醇進行梯度萃取。棄去石油醚萃取液，其它萃取液分別回收溶劑后合并后得2份提取物分別加甲醇 50mL溶解過濾過濾至 100mL容量瓶中，殘渣和容器用少量甲醇多次洗滌，洗液加入容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度[8]，搖勻。65%的乙醇提取物為檢液Ⅰ、95%的乙醇提取物為檢液Ⅱ。取干燥細葉小檗葉粗粉約10g分成2份分別包入濾紙中置2個索氏提取器中水浴回流提取，各加石油醚180mL,回流 2h，棄去石油醚液，分別加65%乙醇，95%乙醇150mL,水浴回流提取2h，回收溶劑后加甲醇定容于100mL容量瓶中65%乙醇提取物為檢液III、95%乙醇為檢液IV。

精密量取檢液Ⅰ、檢液Ⅱ、檢液III、檢液IV各2mL，分別置25mL容量瓶中，按標準曲線制備項下先加5%亞硝酸鈉1.0mL，6min后加10%硝酸鋁1.0mL，6min后加4%氫氧化鈉10mL，加甲醇至刻度搖勻后室溫放置15min后，依次測定吸光度，計算出細葉小檗葉總黃酮含量，結果見表2。

式中x：總黃酮含量，%；

C1：檢測液中總黃酮濃度，mg/mL；

V1：檢測液處理后的體積，mL；

V： 配制的檢測液總體積，mL；

V2：樣品中檢測液的體積，mL；

W：小檗葉樣品干重，mg。

表2 細葉小檗葉的總黃酮含量檢測

2.5 結果

根據(jù)表2分析數(shù)據(jù)得出以下結論：檢液Ⅰ總黃酮含量 0.513%、檢液Ⅱ為 0.291%、檢液III為0.498%、檢液IV為0.288%。細葉小檗葉在提取溶劑為 65% 乙醇，超聲功率為 462W，超聲時間為30min，超聲溫度為60℃的超聲條件下總黃酮提取率最高。

3 討論

取干燥細葉小檗葉粗粉進行活性成分的提取、并做了黃酮檢識試驗，結果均為正反應，證明細葉小檗葉中含有黃酮成分。分別取不同濃度乙醇為溶劑采用超聲波及連續(xù)回流提取法分別對細葉小檗葉中總黃酮成分進行提取，采用比色法對檢液Ⅰ、Ⅱ、III、IV依次進行總黃酮含量測定。結果顯示不同溶劑和不同提取方法得到總黃酮含量也有差別。檢測結果分別為0.513%、0.291%、0.498%、0.288%。因此以65% 乙醇為溶劑，超聲波提取方法，適用細葉小檗葉中總黃酮含量測定。為合理開發(fā)細葉小檗葉提供試驗依據(jù)，細葉小檗葉可以成為黃酮新藥資源。