超濾法分離刺五加果多糖及其抗氧化活性的研究①

沈 宇,趙宏博,趙 宏,王宇亮,王朝興

(1. 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

刺五加(Acanthopanax senticosus (Rupr. Maxim.) Harms)也稱五加參，常以根和莖入藥，但近年來研究發(fā)現(xiàn)其葉和果也是非常好的活性部位，具有較好的治療和保健功效，開發(fā)前景廣闊。刺五加中主要活性成分有刺五加多糖、刺五加苷、維生素、微量元素及氨基酸等，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌、抗疲勞、抗氧化、抗病毒和抗衰老等功效[1～3]。超濾法是一種在分子水平上、無污染、高效節(jié)能的新型分離工藝。超濾是一種以壓力為驅(qū)動力的膜分離技術(shù)，使用孔徑不同的超濾膜對混合液體進(jìn)行物理分離的過程，對比其他的濾膜，超濾膜過濾的精密度更高，膜孔更小[4]。適用于各類物質(zhì)的分離、濃縮、純化和精制，是目前應(yīng)用最為廣泛的膜分離技術(shù)?；钚匝踝杂苫亲杂苫谌梭w內(nèi)與活性較強(qiáng)的含氧物質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物，過多時會使核酸突變，是生物體衰老和患病的根源[5]。因而，抗氧化劑的研究和開發(fā)是現(xiàn)在科學(xué)研究的重點項目之一，尤其是開發(fā)來自天然產(chǎn)物的抗氧化劑。本實驗采用刺五加的果實為原材料，采用水提取醇沉淀法提取刺五加果多糖。采用超濾法對刺五加果多糖進(jìn)行分離，再分別對所得的各級多糖進(jìn)行抗氧化活性的篩選，旨在找到抗氧化活性較好的組分，為刺五加果多糖抗氧化作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

刺五加果(安國市光明飲片加工廠)； 1,1-二-2-苦肼基(DPPH，南京奧多福尼生物科技有限公司)；鄰苯三酚(北京索萊寶科技有限公司)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；牛血清白蛋白(美國Sigma公司)；苯酚(天津凱通化學(xué)試劑廠)。

1.1.2 儀器

KDM可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DZF-6050型真空干燥箱(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；DL-5-B低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)； FW80型高速萬能試樣粉碎機(jī)(河北省黃驊市新興電器廠)；膜分離機(jī)(曲阜市宏鑫機(jī)械廠)；中空纖維膜(湖州科濾膜技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 刺五加果多糖的提取[6]

稱取1.5 kg刺五加果實，粉碎，加入蒸餾水(料液比1:30)浸泡過夜，設(shè)定提取溫度95℃，提取時間115min，趁熱過濾，濃縮，濾渣再以20倍蒸餾水浸泡過夜，按相同提取條件進(jìn)行二次提取，趁熱過濾，濃縮，合并濾液，冷卻至室溫，加入95%乙醇，醇濃度調(diào)至75%以上，低溫靜置24 h，在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取沉淀，蒸餾水復(fù)溶后，旋至無醇味，冷凍干燥，即得刺五加果粗多糖。

1.2.2 刺五加果多糖含量的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用蒸餾水定容至100mL容量瓶中，既得濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL，分別加入具塞試管中加蒸餾水至2mL，再分別加入5%的苯酚溶液1mL，充分搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，搖勻后放置10min，置40℃水浴鍋中保溫15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水用相同方法處理后為空白，使用紫外可見分光光度計在490nm波長處測定吸光度，以葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 多糖含量的測定

精密稱取刺五加果粗多糖樣品20mg，蒸餾水定容至100mL容量瓶中，搖勻，得到0.2mg/mL的樣品溶液。取2 mL待測樣品溶液加入具塞試管中，按照1.2.2.1所述方法進(jìn)行操作，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算刺五加果多糖的含量。

1.2.3 三氯乙酸法脫蛋白

稱取刺五加果粗多糖，蒸餾水超聲溶解1h，冷卻至室溫，不斷攪拌的同時加入體積比為1:1的5%三氯乙酸(TCA)溶液(W/V)，置4℃下冷藏24h，3000r/min離心15min，取上清液。加入飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至中性，濃縮后加入95%乙醇，并調(diào)節(jié)醇濃度在75%以上，常溫下靜置24h，3000r/min離心15min，取沉淀，真空干燥，即得刺五加果多糖。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定

1.2.4.1 考馬斯亮藍(lán)染色液的配制

精密稱取考馬斯亮藍(lán)G250標(biāo)準(zhǔn)品50mg，加入25mL 的95%乙醇，再加入50mL 的85%磷酸完全溶解，加蒸餾水定容至500mL容量瓶中既得濃度為0.01%的考馬斯亮藍(lán)染色液。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10mg，蒸餾水溶解后定容至100mL容量瓶中，既得濃度為0.1mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置于試管中，加蒸餾水至1.0mL，再加0.01%考馬斯亮藍(lán)染色液5mL，搖勻，靜置3min。用蒸餾水以相同方法處理后為空白，使用紫外可見分光光度計在595nm波長處測定吸光度，橫坐標(biāo)為牛血清蛋白的濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)含量的測定

精密稱取刺五加果多糖樣品20mg，用蒸餾水定容至100mL容量瓶中，制得濃度為0.2mg/mL刺五加果多糖樣品溶液。取刺五加果多糖樣品溶液1mL，按照1.2.4.2所述方法進(jìn)行操作，用紫外可見分光光度計在595nm波長處測定吸光度，利用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 超濾法分離刺五加果多糖

純化后的刺五加果多糖溶于1000mL蒸餾水中，超聲加熱溶解1h，倒入超濾分離機(jī)的料箱中，超濾分離裝置見圖1。安裝中空纖維膜組件(150kDa、100 kDa、50 kDa、10 kDa)，打開膜分離機(jī)電源開關(guān)，調(diào)節(jié)流量計使其保持恒速，調(diào)節(jié)控壓閥使壓力表指針在0.1MPa左右，未通過中空纖維膜的截留液流回料箱中，濾過液流向濾液罐，濾液用Molish反應(yīng)來鑒別是否還含有多糖，直至Molish反應(yīng)無現(xiàn)象時，即濾過液中不再含有多糖為止。料箱中加入蒸餾水關(guān)閉濾液口，進(jìn)行反清洗，將黏附于中空纖維膜上的多糖樣品清洗下來，與截留液合并。濃縮后的截留液中加入95%乙醇，調(diào)節(jié)醇濃度至75%以上，得醇沉液，常溫靜置24h，3000r/min離心15min，取沉淀，冷凍干燥，即得不同分子量分布的刺五加果多糖。

圖1 超濾分離裝置圖1.料箱;2.流量計;3.壓力泵;4.中空纖維膜;5.控壓閥;6.壓力表;7.濾液罐

1.2.6 刺五加果多糖的抗氧化活性篩選

1.2.6.1 DPPH清除能力的測定[7]

分別配置5個濃度梯度的各部分刺五加果多糖溶液各2.0mL，分別加入0.2mmol/mL的DPPH溶液各2mL于玻璃試管中，搖勻，避光靜置0.5h后，用酶標(biāo)儀于517nm處測定其OD值。以維生素C為陽性對照品，相同條件下，每一樣品平行測3次，取其平均值。

多糖對DPPH的清除率公式為：

A0是樣品溶液與DPPH溶劑混合液的OD值；A1是樣品溶液與DPPH溶液混合液的OD值；A2是未加樣品的溶液與DPPH溶液混合液的OD值。

1.2.6.2 超氧自由基O2-清除能力的測定

采用鄰苯三酚法測定各部分刺五加果多糖對超氧自由基O2-的清除能力。將配置好的0.005mol/L的鄰苯三酚溶液和pH為8.2的Tris-HCL緩沖溶液在25℃的恒溫水浴鍋中保溫10min，取不同濃度的待測樣品溶液各2mL，分別依次加入預(yù)熱的Tris-HCL緩沖溶液3mL和鄰苯三酚溶液 0.5mL，搖勻后，在25℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)4min，加入一定量的HCl終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于320nm處測定其OD值。以維生素C為陽性對照品，相同條件下，每一樣品平行測3次，取其平均值。多糖對超氧自由基O2-的清除率公式為：

A0是空白對照組的OD值；A1是加入多糖樣品溶液OD值。

2 結(jié)果

2.1 刺五加果多糖的提取結(jié)果

從1.5kg的刺五加果中提取得到的粗多糖為163.24g，刺五加果多糖的提取率為10.88%。

2.2 刺五加果多糖含量的測定結(jié)果

采用苯酚硫酸法測定各部分刺五加果多糖的含量，葡萄糖線性回歸方程為y=13.52x+0.0104，R2=0.9991。刺五加果粗多糖中多糖的含量為46.75%，經(jīng)脫蛋白處理，超濾分離后各部分多糖含量分別為分子量>100kDa組分多糖含量為67.28%；分子量100～50kDa組分多糖含量為61.32%；分子量50～10kDa組分多糖含量為88.15%；分子量<10kDa組分多糖含量為53.27%，見圖2。從多糖的含量結(jié)果分析，刺五加果多糖中50～10kDa組分中的多糖含量最高，其次為>100kDa組分，含量最小的組分為低于10kDa的組分，但經(jīng)純化分離后的多糖各組分的含量均大于刺五加果粗多糖。

圖2 各組分多糖含量測定

2.3 刺五加果多糖的除蛋白結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液的濃度對其在595nm波長處的吸光度作回歸方程為Y =6.97x+ 0.0962，R2=0.9996。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。刺五加果粗多糖中的蛋白質(zhì)含量為0.1267mg/mL，采用三氯乙酸法除蛋白后，蛋白質(zhì)含量降為0.0566 mg/mL，蛋白質(zhì)的脫除率為55.33%。

圖3 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 刺五加果多糖超濾法的分離

刺五加果多糖的超濾法分離結(jié)果見表1，各組分比例見圖4。超濾法分離得到刺五加果多糖分子量>100kDa的組分為15.34g ，占多糖總量的19.0%；分子量在100～50kDa之間的組分為27.47g ，占多糖總量的34.0%，分子量在10～50kDa之間的組分為34.67g，占多糖總量的42.9%；分子量<10kDa的組分為3.25g，占多糖總量的4.1%。分離結(jié)果表明刺五加果多糖中相對分子質(zhì)量在100～50kDa的組分含量最多，<10kDa的組分含量最少，不同分子量范圍的多糖組分在含量上呈現(xiàn)不均一的分布。

表1 刺五加果多糖超濾法分離結(jié)果

圖4 刺五加果多糖各組分比例

2.5 刺五加果多糖抗氧化活性篩選

2.5.1 DPPH·清除能力的測定

刺五加果多糖各組分對DPPH自由基的清除率見圖5，不同分子量的刺五加果多糖組分對DPPH自由基均有不同程度的清除作用，并隨其質(zhì)量濃度的增大而增大，4個組分的質(zhì)量濃度在0.6～1.0mg/mL時清除率增長緩慢，處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。清除率結(jié)果表明刺五加果多糖50～10kDa組分對DPPH自由基的清除率效果最好，清除率可達(dá)到56.89%，其次為100～50kDa組分，但與Vc陽性組比較對DPPH自由基清除能力相對較弱。

2.5.2 超氧自由基O2-清除能力的測定果

刺五加果多糖各組分對超氧自由基O2-的清除率見圖6，不同分子量的刺五加果多糖組分對超氧自由基O2-均有不同程度的清除作用，并隨其質(zhì)量濃度的提高而具有一定的上升趨勢，在0.5～1.5mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率急劇增大，而在0.6～1.0mg/mL時清除率增長緩慢，處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。刺五加果多糖50～10kDa組分對超氧自由基O2-的清除率最好，清除率可達(dá)到40.69%，其次為100～50kDa組分，但與Vc陽性組比較對超氧自由基O2-清除能力相對較弱。

3 討論

本研究采用優(yōu)化的提取工藝提取刺五加果多糖，多糖提取率達(dá)到了10.88%，經(jīng)三氟乙酸法脫除蛋白后，采用超濾技術(shù)對刺五加果多糖進(jìn)行了分離和純化，得到分子量為>100kDa組分、100～50kDa組分、50～10kDa組分和<10kDa組分，其中50～10kDa組分所占比例最高為42.9%，100～50kDa組分次之，并且各組分經(jīng)分離后，多糖含量與粗多糖相比較都得到了一定的提高。因此，超濾技術(shù)是一種有效的分離和純化多糖的手段，并且具有無污染、快速、準(zhǔn)確的將多糖進(jìn)行分子量分級的優(yōu)點，從而提高了實驗效率。為了比較分離后各個組分生物活性的高低，對分離后的4個組分進(jìn)行了抗氧化活性的篩選，通過對DPPH和超氧自由基O2-清除能力的測定發(fā)現(xiàn)，各組分的抗氧活性略有不同，篩選出活性較好的組分為50～10kDa組分，其清除率分別為56.89%和40.69%，具有較好的抗氧化活性，具有進(jìn)一步開發(fā)的價值。