苦參堿減輕阿霉素致心肌細胞凋亡作用的研究①

王倩倩，盧均坤，王燕琴

(1.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007；2.湛江市第一中醫(yī)院，廣東 湛江 524043；3.佳木斯大學校醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007)

阿霉素是臨床應用廣泛的化療藥物，在臨床中被廣泛應用于惡性腫瘤的治療，但因其劑量依賴性的心肌損傷而限制了臨床應用，阿霉素通過氧化應激、DNA損傷、心肌纖維化、細胞凋亡等導致心肌損傷[1～3]。蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性可以分成急性、慢性和遲發(fā)性心臟毒性，多數(shù)患者在蒽環(huán)類藥物給藥后可較快地發(fā)生心肌損傷，且隨著時間的延長愈加明顯[4]。在給予蒽環(huán)類藥物的數(shù)年后，超過50% 的患者可發(fā)生左心室組織和功能亞臨床心臟超聲變化，并且蒽環(huán)類藥物沒有絕對的“安全劑量”[5]。

研究顯示線粒體呼吸鏈復合物I不僅產(chǎn)生ATP，而且在細胞凋亡中起重要作用。叢生蛋白(CLU)的過表達減輕了六價鉻[Cr(VI)]誘導的線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ抑制、ROS積累、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放和線粒體膜電位(MMP)塌陷，CLU誘導的線粒體呼吸鏈復合物I活性增加對Cr(VI)誘導的L-02肝細胞細胞毒性具有保護作用[6]。研究表明，DOX誘導MMP耗竭和MPTP開放，從而導致能量穩(wěn)態(tài)紊亂，線粒體腫脹，外膜破裂，并促凋亡介質(zhì)釋放[7]。

苦參堿是中國傳統(tǒng)的中藥，苦參堿及其衍生物有廣泛的藥理作用，被廣泛應用在抗肝炎、抗肝纖維化[8]，治療癌癥[9]、抗病毒[10]，治療心血管疾病等[11]，苦參堿能夠減輕放射性損傷的器官損傷[12]?？鄥A能夠顯著減輕心力衰竭患者心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)、降低谷草轉(zhuǎn)氨酶水平、乳酸脫氫酶水平、顯著提高心力衰竭大鼠的射血分數(shù)，減輕心肌細胞凋亡[13]。既往研究中我們發(fā)現(xiàn)150mg/L苦參堿對阿霉素引起的心肌細胞凋亡具有顯著的保護作用[14]。因此本實驗繼續(xù)通過制備阿霉素致H9c2心肌細胞損傷的體外模型，給與苦參堿預處理，研究苦參堿在阿霉素致H9c2心肌細胞損傷中的凋亡、線粒體膜電位及線粒體呼吸鏈復合物I的影響。

1 材料

1.1 細胞

H9c2細胞系是大鼠心肌細胞系(購買自中國科學院上海生命科學研究所)，H9c2心肌細胞的正常生長條件是：37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細胞貼壁生長。

1.2 藥品和試劑

注射用苦參堿(山東瑞陽藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.15g/支)，注射用阿霉素(浙江海正藥業(yè)有限公司，規(guī)格10mg/支)，Hoechst染色試劑盒，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)均購自碧云天生物技術(shù)公司。線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

H9c2心肌細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%時，棄培養(yǎng)基，2～5mL PBS液沖洗兩遍，加0.25%胰蛋白酶700μL，消化30s后，細胞開始脫離瓶壁時，加入5mL培養(yǎng)基終止消化，按適當比例分到新的培養(yǎng)瓶中，按照細胞培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至2～3代細胞進行分組試驗。

2.2 細胞生存率檢測

如2.1進行分組加藥處理，每組設(shè)6個復孔，作用24h后，抽出培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，將2mL MTT溶劑加入20mL完全培養(yǎng)液中，充分混勻，每孔加200μL，放入培養(yǎng)箱孵育4h 后抽出，每孔加150μL DMSO。酶標儀測各孔480nm波長處的光密度(OD)。MTT法檢測單獨阿霉素、單獨苦參堿、苦參堿+阿霉素、空白對照組的細胞生存率，繪制生存率曲線，并進一步確定苦參堿的濃度范圍，細胞生存率=給藥組OD/空白對照組OD×100%。

2.3 分組設(shè)置及給藥方式

空白對照組：接受生理鹽水作為干預因素；阿霉素組：接受濃度1.0mg/L阿霉素作為損傷模型；阿霉素+苦參堿組：給與濃度150mg/L的苦參堿3h后再接受濃度1.0mg/L阿霉素；苦參堿組：接受濃度150mg/L苦參堿作為干預因素，放至37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，進行下一步試驗。

2.4 細胞凋亡檢測

取無菌蓋玻片置于六孔板中，將H9c2心肌細胞接種于六孔板中,調(diào)細胞濃度為1.1×105個/mL，每孔3mL，培養(yǎng)過夜，如2.3進行分組加藥處理，作用24h后，吸去舊培養(yǎng)液，按照細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒說明書進行染色。Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。

2.5 線粒體膜電位檢測

按照線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)說明書進行染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。

2.6 線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ檢測

按照線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ說明書進行操作。復合物Ⅰ(EC1.6.5.3)又稱NADH-CoQ還原酶或NADH脫氫酶的主要元素，復合物I催化NADH氧化。廣泛存在于動物、植物、 微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復合物。該酶催化一對電子從 NADH 傳遞給CoQ，同時可使O2還原生成O2-，是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生 O2-的主要部位。測定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態(tài)，而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態(tài)。線粒體復合物Ⅰ能夠催化NADH 脫氫生成 NAD+，在酶標儀340nm波長下測定NADH 的氧化速率計算出該酶活性的大小。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 細胞生存率

細胞生存率是在96孔板培養(yǎng)24h，觀察細胞生長及死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組H9c2心肌細胞生長良好，貼壁良好，極少有漂浮死亡細胞(定義為100%)。阿霉素組漂浮死亡細胞較多，同空白對照組有顯著差異(P<0.05)。H9c2心肌細胞生存率在阿霉素+苦參堿組同單純阿霉素組比較有顯著差異(P< 0.05)，單純苦參堿組的細胞生長情況良好細胞增值略有增加，同空白對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 不同組別H9c2心肌細胞生存率

3.2 細胞凋亡

分別比較不同藥物作用于H9c2心肌細胞24h后，與空白對照組比較，阿霉素組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，與阿霉素組比較苦參堿+阿霉素組，細胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖1，表2。

空白對照組 阿霉素組(1mg/L) 苦參堿(150mg/L)+阿霉素組(1mg/L)圖1 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡染色(×20)

表2 不同組別H9c2心肌細胞凋亡率

3.3 線粒體JC-1膜電位

分別比較不同藥物作用于H9c2心肌細胞24h線粒體膜電位，與阿霉素組比較，苦參堿+阿霉素組細胞綠色熒光明顯減少(P<0.05)、紅色熒光顯著增加(P<0.05)，與空白對照組比較，阿霉素組心肌細胞綠色熒光顯著增多(P<0.05)甚至接近陽性質(zhì)控指標，說明阿霉素對線粒體膜電位損害嚴重，各組紅色熒光/綠色熒光比率，見圖2及表3。

圖2 不同組別H9c2心肌細胞線粒體膜電位激光共聚焦JC-1染色(×40)

表3 不同組別H9c2心肌細胞線粒體激光共聚焦JC-1染色情況

3.4 線粒體呼吸鏈復合物

與空白對照組比較，阿霉素組H9c2細胞線粒體呼吸鏈復合物I活性下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與阿霉素組比較，苦參堿+阿霉素組心肌細胞線粒體呼吸鏈復合物I活性顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同組別H9c2心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ活性檢測

4 討論

惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)公共健康問題，隨著年齡增長，發(fā)病率也隨之上升，治療惡性腫瘤常用的化療藥物如蒽環(huán)類藥物，通常與心臟毒性相關(guān)，阿霉素(蒽環(huán)類藥物)可以引起遠期心力衰竭[15]。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)，在使用阿霉素累積量達到400、500、和550mg/m2，心力衰竭發(fā)生率分別達到5%、16%、26%[16]。盡管阿霉素具有心臟毒性作用，但臨床中因為沒有更好的替代藥物，還是被廣泛的應用。因此，發(fā)現(xiàn)能夠降低阿霉素的心臟毒性作用，并且不影響阿霉素的治療功能，是我們迫切的任務。阿霉素能特異性與線粒體內(nèi)膜豐富的心磷脂結(jié)合，導致線粒內(nèi)阿霉素聚集，抑制線粒體呼吸鏈復合物I和II的活性，破壞電子聯(lián)傳遞，進一步促進ROS產(chǎn)生[17]。

在本實驗中，我們通過MTT法檢測給與阿霉素后H9c2心肌細胞的生存率發(fā)現(xiàn)，阿霉素可以導致H9c2心肌細胞生存率大幅度下降。在單純苦參堿共孵育H9c2心肌細胞時，心肌細胞數(shù)量較空白對照組略有增加，這可能是苦參堿促進細胞增殖作用的結(jié)果。在苦參堿預處理后再給與阿霉素顯著提高H9c2心肌細胞生存率。由此，我們得出結(jié)論，苦參堿預處理，能抑制阿霉素對心肌細胞的傷害。

本實驗利用細胞凋亡-Hoechst染色法觀察H9c2心肌細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠顯著降低阿霉素引起的心肌細胞凋亡，苦參堿的藥理作用廣泛，臨床應用較多，有研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能顯著減輕缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)細胞凋亡及形態(tài)學的損傷，顯著降低丙二醛(MDA)的水平，提高超氧化物歧化(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性[18]。在心力衰竭方面有研究發(fā)現(xiàn)[19]，苦參堿能夠改善心力衰竭大鼠的左室射血分數(shù)、減輕心肌細胞凋亡、抑制心肌纖維化。也有研究表明，苦參堿能夠減輕左心房心肌纖維化，降低 I、III型膠原蛋白水平，預防心肌梗死后心房纖顫的發(fā)生[20]。這些研究，也表明苦參堿在保護阿霉素引起的心肌損傷中，具有重要的理論依據(jù)。

氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的三羧酸循環(huán)在ATP酶作用下產(chǎn)生ATP，儲存于線粒體內(nèi)膜，這些轉(zhuǎn)換不僅形成質(zhì)子梯度，還形成氫離子的跨膜電勢，產(chǎn)生MMP。在正常情況下，維持細胞內(nèi)的ATP水平和穩(wěn)定的MMP，對于維持細胞正常生理功能至關(guān)重要[21]。阿霉素可以使MMP大幅下降，當線粒體功能障礙時MMP下降，伴隨著ROS產(chǎn)生增加、損害ATP的生成，這些在阿霉素引起的中毒性心肌病中尤為重要[22]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，阿霉素可以使線粒體膜電位顯著降低，說明線粒體通透性(mitochondria permeability transition，MPT)顯著增加，苦參堿顯著改善阿霉素引起的MMP下降。

我們的實驗進一步發(fā)現(xiàn)，H9c2心肌細胞在阿霉素的作用下，線粒體呼吸鏈復合體物I的活性顯著降低，而苦參堿能顯著提高因阿霉素損害的心肌細胞線粒體呼吸鏈復合體物I活性。線粒體呼吸鏈復合體物I是線粒體呼吸鏈中第一個也是最大的復合體，線粒體F1F0-ATP合酶利用電子傳遞鏈上的線粒體呼吸鏈復合體物I、線粒體呼吸鏈復合體物III、線粒體呼吸鏈復合體物IV所產(chǎn)生的質(zhì)子梯度，線粒體呼吸鏈上發(fā)生的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，這些復合物活性的改變會導致線粒體電化學梯度和ATP合成的降低[23]，有研究在擴張型心肌病以及心肌缺血性疾病中，損害了線粒體呼吸鏈復合體物的活性，最終引起心力衰竭[24]。阿霉素能夠使包括線粒體呼吸鏈復合體物I和線粒體呼吸鏈復合體物Ⅱ的活性降低，引起持久的線粒體呼吸鏈的損害，同時長久阿霉素暴露引起MMP下降[25]。

我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，苦參堿預處理能夠顯著減輕阿霉素引起的心肌細胞凋亡，其途徑可能是苦參堿顯著抑制了阿霉素引起的線粒體膜電位下降，提高了線粒體呼吸鏈復合物I的活性。在今后的實驗中我們繼續(xù)研究苦參堿對大鼠的心肌組織的保護作用。