基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討白花蛇舌草-半枝蓮抗肝細胞癌的作用機制

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是一種發(fā)病率極高的惡性腫瘤，病情進展快，患者5年生存率低[1]。 肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是PHC最常見的病理類型，因其早期癥狀隱匿，大部分HCC患者確診時已處于中晚期，已錯失根治性手術(shù)的最佳時機。目前HCC的治療方式大多為手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療等，但往往伴隨嚴重的不良反應(yīng)。因此，如何抑制HCC的發(fā)生發(fā)展，減少不良反應(yīng)，延長患者生存期，已成為現(xiàn)今的研究熱點。中醫(yī)藥在延緩HCC疾病進展、緩解治療副反應(yīng)、提高患者生活質(zhì)量等方面優(yōu)勢顯著[2]，日漸成為綜合性治療的重要組成部分。

中醫(yī)認為，HCC可歸屬于“肝積”“黃疸”“肥氣”等范疇，病機屬正虛邪侵，為機體陰陽氣血失調(diào)，痰濕熱毒內(nèi)生，積聚于脅下而成腫塊，故治療上當(dāng)清熱毒、調(diào)氣血、益肝用。白花蛇舌草-半枝蓮為臨床常用清熱解毒藥對，白花蛇舌草兼有消腫止痛、半枝蓮兼有活血化瘀的功效，二者相伍，共奏抗癌奇功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白花蛇舌草的化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜類、黃酮類、蒽醌類等化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎等多種生物活性[3]；半枝蓮的主要活性成分為黃酮類、二萜及其內(nèi)酯類、多糖類化合物，具有良好的抗癌、護肝及抗病毒作用[4]。研究證實，兩藥聯(lián)合能夠誘導(dǎo)細胞凋亡、增強免疫功能，較單藥對腫瘤細胞的抑制作用更加明顯[5]。然而由于中藥多成分、多靶點的特性，白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗HCC的具體作用機制尚未闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，能夠?qū)χ兴幓钚猿煞旨皾撛谧饔冒悬c進行系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)性研究，這恰好與中藥多層次、多靶點、多通路的特性相符。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分及治療HCC的潛在靶點，并探索其作用機制，為深入研究HCC的診治奠定基礎(chǔ)。本研究整體框架見圖1。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體研究框架Fig.1 The whole framework of the study based on network pharmacology

1 材料和方法

1.1 白花蛇舌草-半枝蓮活性成分及靶點的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/）檢索白花蛇舌草、半枝蓮的化學(xué)成分，同時收集其藥物動力學(xué)參數(shù)，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18為標(biāo)準[6]，篩選其有效活性成分，將收集到的藥物活性成分導(dǎo)入到Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）中進行蛋白靶點的篩選匹配。為了提高數(shù)據(jù)的標(biāo)準性及統(tǒng)一性，進一步運用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），查詢其蛋白靶點名所對應(yīng)的人類基因名稱，并匹配整理藥物靶點。

1.2 HCC相關(guān)靶點的篩選 選擇GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫、人類在線孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.omim.org/）、 治療目標(biāo)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）、肝細胞癌腫瘤數(shù)據(jù)庫（Oncogenomic Database of Hepatocellular Carcinoma，OncoDB.HCC） （http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw）和Liverome數(shù)據(jù)庫（http://liverome.kobic.re.kr/），以“Hepatocellular carcinoma”或“HCC”為關(guān)鍵詞檢索HCC相關(guān)靶點，整合并刪除重復(fù)項。通過R語言（Version 3.6.1）將藥物靶點與疾病靶點進行匹配，取交集作為白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的潛在作用靶點。

1.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 選用可視化軟件Cytoscape（Version 3.7.1）構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，以闡明白花蛇舌草-半枝蓮藥對中活性成分與疾病靶點的關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)下方節(jié)點代表篩選后白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療疾病的潛在作用靶點，網(wǎng)絡(luò)上方節(jié)點代表白花蛇舌草-半枝蓮藥對的共活性成分，邊代表白花蛇舌草-半枝蓮藥對與其活性成分、活性成分與潛在作用靶點、潛在作用靶點與疾病的相互關(guān)系。

1.4 構(gòu)建靶點蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò) 將交集后的潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）處理，限定物種為“Homo sapiens”進行檢索，構(gòu)建白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗HCC作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析 對于網(wǎng)絡(luò)中的每個節(jié)點，使用Cytoscape軟件中的Network Analyzer工具及cytoNCA插件對其進行拓撲分析。選擇3個參數(shù)來評估其拓撲特征：（1）連接度中心性（degree centrality，DC），即與一個節(jié)點直接相連的節(jié)點個數(shù)；（2）緊密度中心性（closeness centrality，CC），即從一個節(jié)點到其他節(jié)點的平均距離；（3）中介中心性（betweeness centrality，BC），即經(jīng)過某個節(jié)點的最短路徑數(shù)目。這3個參數(shù)在網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用，DC越高，CC、BC越大，節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的核心地位越高。根據(jù)上述參數(shù)進行網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點的篩選。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 利用R語言中Bioconductor平臺及Cytoscape中Cluego插件對預(yù)測得到的關(guān)鍵靶點進行GO和KEGG富集分析，篩選條件為P＜0.05，Q＜0.05，分析結(jié)果以條形圖、氣泡圖及餅狀圖呈現(xiàn)。隨后用Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/）對富集通路進行整合。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分及作用靶點 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到白花蛇舌草化學(xué)成分37個，半枝蓮化學(xué)成分94個；設(shè)定OB≥30%，DL≥0.18進一步篩選后，最終納入共活性成分3個，白花蛇舌草活性成分4個（除去3個共活性成分），半枝蓮活性成分26個（除去3個共活性成分）。見表1。將上述33個活性成分導(dǎo)入到Drugbank數(shù)據(jù)庫，共收集到236個蛋白靶點。進一步查詢Uniprot數(shù)據(jù)庫后，得到88個白花蛇舌草、104個半枝蓮對應(yīng)靶點，刪除87個重復(fù)項后，最終得到105個藥物靶點。

2.2 HCC相關(guān)靶點 通過檢索，在GeneCards、OMIM、TTD、Drugbank、OncoDB.HCC和Liverome數(shù)據(jù)庫中分別獲得6 592、200、47、14、325和241個HCC相關(guān)靶點，刪除重復(fù)項后共篩選得到6 832個HCC相關(guān)靶點，與105個藥物共同靶點匹配后，交集得到89個白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的潛在作用靶點。見圖2。

2.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析 將白花蛇舌草-半枝蓮活性成分、潛在作用靶點、HCC靶點及其屬性導(dǎo)入到Cytoscape，建立“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。見圖3。利用Network Analyzer計算節(jié)點DC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草-半枝蓮藥對中DC居前5位的活性成分分別為槲皮素（quercetin，degree=121）、木犀草素（luteolin，degree=28）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree=22）、黃芩素（baicalein，degree=19）及漢黃芩素（wogonin，degree=19）。見表2。以上成分均為白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的關(guān)鍵活性成分。分析網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，藥對中相同活性成分能同時作用于多個靶點，而相同靶點亦對應(yīng)多種活性成分，證明白花蛇舌草-半枝蓮藥對能夠多成分、多靶點發(fā)揮治療作用。

2.4 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗HCC的89個潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫平臺，剔除1個無相互作用關(guān)系的蛋白后，得到由88個節(jié)點及864條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖4。進一步應(yīng)用CytoNCA計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲參數(shù)，并進行核心靶點的篩選。DC的中位數(shù)為14，CC的中位數(shù)為0.52，BC的中位數(shù)為0.003868，基于這3個參數(shù)的中位數(shù)進行第1次篩選，即篩選條件為DC≥14，CC≥0.52，BC≥0.003868，共得到31個關(guān)鍵靶點。隨后設(shè)定閾值為DC≥40，CC≥0.655462，BC≥0.035574進行第2次篩選，最終得到6個核心靶點，包括白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3，CASP3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、myc基因、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）。最后構(gòu)建核心靶點與白花蛇舌草-半枝蓮活性成分關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。見圖5。

表1 白花蛇舌草-半枝蓮潛在活性成分Tab.1 Potential active components of Hedyotis diffusa-Scutellariae barbatae Herba

圖2 白花蛇舌草-半枝蓮作用靶點與HCC相關(guān)靶點交集Fig.2 Interaction of Hedyotis diffusa-Scutellariae barbatae Herba related targets and HCC related targets

圖3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Drug-component-target” network

2.5 GO功能富集分析 通過R語言對潛在作用靶點進行分析，以P＜0.05為條件，共篩選得到1 196個GO條目，其中生物過程（biological process，BP）條目1 067個，細胞組分（cellular component，CC）條目39個，分子功能（molecular function，MF）條目90個。 結(jié)果顯示，BP方面，白花蛇舌草-半枝蓮藥對主要參與對類固醇激素、外源刺激、氧化應(yīng)激等的反應(yīng)過程；CC方面，白花蛇舌草-半枝蓮藥對與細胞各個部分均有密切聯(lián)系，包括細胞膜、細胞核、線粒體等；MF方面，白花蛇舌草-半枝蓮藥對主要與核受體功能、轉(zhuǎn)錄因子活性、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合等功能有關(guān)。此結(jié)果證實白花蛇舌草-半枝蓮藥對可通過調(diào)控多種生物學(xué)途徑發(fā)揮對HCC的治療作用，進一步分析發(fā)現(xiàn)這些生物學(xué)途徑主要與細胞增殖、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和血管生成有關(guān)。以條形圖展示校正后P值排名前20位的結(jié)果。見圖6。

表2 DC居前5位的關(guān)鍵活性成分信息Tab.2 Information of key-components of DC in the top 5

2.6 KEGG通路富集分析 通過Cluego將潛在作用靶點與KEGG信號通路進行匹配，共富集得到80條信號通路，其中p53抑癌基因通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt） 通路、 缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、VEGF通路是關(guān)鍵信號通路。見表3。此外，膀胱癌通路、結(jié)直腸癌通路、乳腺癌通路等也被顯著富集，這表明白花蛇舌草-半枝蓮藥對能夠通過多個信號通路發(fā)揮抗HCC及多種惡性腫瘤的作用，且其作用靶點可能為多種惡性腫瘤的共同靶標(biāo)。最后，對KEGG通路富集分析行可視化處理，并在Metascape數(shù)據(jù)庫中進行驗證。見圖7。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network

圖5 “核心靶點-關(guān)鍵成分”網(wǎng)絡(luò)Fig.5 “Core targets-key components” network

3 討論

中醫(yī)認為，本虛標(biāo)實為HCC之基本病機。正氣先虛，加之情志過極，飲食勞倦，機體陰陽氣血失衡，氣滯痰凝血瘀而成癌毒。癌毒與痰瘀互結(jié)，郁久化熱，更成熱毒，毒熱內(nèi)結(jié)為HCC發(fā)生的關(guān)鍵病機。臨床上HCC患者也常表現(xiàn)出發(fā)熱、疼痛、口苦、煩躁、尿黃、便秘等熱毒之癥。《素問·至真要大論》云：“寒者熱之，熱者寒之……”因此對于熱毒引發(fā)的惡性腫瘤，應(yīng)用清熱解毒的寒涼類方藥治療。作為清熱解毒類方藥的代表，有文獻報道，白花蛇舌草聯(lián)合半枝蓮能夠有效抑制HCC的發(fā)生發(fā)展[7]。但由于中藥多成分、多靶點作用的特性，該藥對治療HCC的具體成分、靶點及機制至今尚不明確。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的潛在靶點及作用機制。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲分析結(jié)果，得到5種關(guān)鍵成分，6個核心靶點，結(jié)合GO功能及KEGG通路富集分析得到的5條關(guān)鍵通路，白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡、控制炎癥、抗血管生成等多途徑發(fā)揮治療作用。

圖6 關(guān)鍵靶點的GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis for key targets

3.1 細胞增殖 細胞周期調(diào)節(jié)失控所致的細胞異常增殖，是惡性腫瘤的關(guān)鍵特征之一[8]。EGFR是表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）的受體，廣泛分布于上皮細胞、成纖維細胞等多種細胞表面，參與細胞增殖及信號傳導(dǎo)。EGF和EGFR的結(jié)合導(dǎo)致EGFR的二聚化，進一步激活PI3K-Akt通路，抑制細胞增殖[9]。myc是細胞增殖和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄程序，從而影響多種人類腫瘤細胞的增殖和代謝[10]。本研究分析篩選得出，白花蛇舌草-半枝蓮藥對的關(guān)鍵靶點包括與細胞增殖相關(guān)的EGFR、myc，關(guān)鍵信號通路包括PI3K-Akt信號通路，說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分槲皮素及木犀草素等可能是通過抑制EGFR及myc表達，調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路，從而抑制細胞增殖。且有研究證實，槲皮素可抑制EGFR及其下游信號分子PI3K、Akt的表達[11]；木犀草素可抑制Akt和PI3K的磷酸化[12]，抑制細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗HCC的作用，與本研究結(jié)果一致。

表3 關(guān)鍵KEGG信號通路信息Tab.3 Information on key KEGG signaling pathway

圖7 可視化KEGG通路富集分析Fig.7 Visual analysis of KEGG pathway enrichment

3.2 細胞凋亡 研究已證實，細胞增殖與凋亡的穩(wěn)態(tài)失衡是腫瘤的發(fā)病機制之一[13]。機體內(nèi)凋亡信號可激活CASP表達，刺激細胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路，而CASP3是CASP家族中最重要的一種，可通過級聯(lián)放大反應(yīng)促細胞凋亡。HIF-1和p53信號通路為促細胞凋亡關(guān)鍵通路，其中HIF-1作為一種促凋亡因子，能夠激活凋亡前體蛋白表達，同時p53能直接與HIF-1的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）相結(jié)合，最終誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。本研究富集分析結(jié)果表明，白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分可能通過調(diào)節(jié)HIF-1和p53信號通路，誘導(dǎo)下游的CASP級聯(lián)反應(yīng)，從而促進腫瘤細胞凋亡。進一步分析提示，白花蛇舌草-半枝蓮藥對中的相關(guān)活性成分包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩素及漢黃芩素等，以上活性成分都能通過CASP3級聯(lián)反應(yīng)，促進細胞凋亡。

3.3 炎癥反應(yīng) 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境息息相關(guān)。炎癥反應(yīng)的刺激能產(chǎn)生多種趨化因子，從而形成炎癥微環(huán)境，促進腫瘤細胞的增殖遷移。IL-6作為一種重要的炎癥細胞因子，可經(jīng)自分泌和旁分泌途徑影響腫瘤細胞的增殖與分化。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能夠介導(dǎo)正常成纖維細胞與腫瘤細胞之間的相互作用，并促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[15]。NF-κB是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進腫瘤中炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，刺激機體分泌更多的IL-6等細胞因子，起到抑制腫瘤細胞凋亡的作用[16]。本研究富集分析結(jié)果提示，白花蛇舌草-半枝蓮藥對中的槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等成分可能通過降低IL-6水平，減少NF-κB表達，抑制NF-κB信號通路，從而下調(diào)下游炎癥因子表達水平，控制炎癥反應(yīng)。此外，有研究表明癌性疼痛與某些炎性因子的表達密切相關(guān)[17]，由此進一步推測白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過抑制IL-6、NF-κB信號通路，從而發(fā)揮抗炎作用，緩解HCC引起的癌痛。

3.4 血管生成 血管生成在腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，而HCC組織中存在著豐富的脈管系統(tǒng)。VEGFA是最重要的血管生成因子[18]，其在HCC組織中的表達明顯高于正常組織[19]，VEGFA能夠上調(diào)HIF-1α的表達，還可以作為一種自分泌生長因子，刺激腫瘤血管的生成[20-21]。本研究篩選發(fā)現(xiàn)VEGFA為白花蛇舌草-半枝蓮藥對的關(guān)鍵靶點，HIF-1及VEGF信號通路為其關(guān)鍵信號通路，提示白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過作用于HIF-1α從而下調(diào)VEGFA表達水平，進一步抑制VEGF信號通路，抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的作用進行了系統(tǒng)分析，明確了白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過p53、PI3K-Akt、HIF-1、NF-κB、VEGF等信號通路發(fā)揮抗HCC作用，符合中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的機制特點。本研究的結(jié)果為后續(xù)實驗研究提供了方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，但仍存在數(shù)據(jù)庫信息不完整、數(shù)據(jù)源算法與臨床存在差異等問題，有待進一步探究。因此，積極開發(fā)智能數(shù)據(jù)庫、進行深入的體內(nèi)外實驗探究，為臨床治療提供新的方向及依據(jù)，是中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展方向之一。