基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討健脾祛濕化瘀膏對(duì)支氣管擴(kuò)張緩解期的作用機(jī)制

秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院 河北，秦皇島 066000

支氣管擴(kuò)張是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，由于感染或阻塞引起支氣管管腔充血、水腫、分泌物阻塞，導(dǎo)致管腔狹小、引流不暢而加重感染[1-3]，其臨床表現(xiàn)為慢性咳嗽伴大量膿痰和（或）反復(fù)咯血[4]。本病易并發(fā)肺源性心臟病、胸膜炎、膿胸，甚至心力衰竭，且病情遷延反復(fù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-7]。支氣管擴(kuò)張可分為急性加重期及緩解期，目前西醫(yī)治療的重點(diǎn)集中在急性加重期，以控制感染、化痰為主[8-10]，而對(duì)于支氣管擴(kuò)張緩解期尚缺乏有效的治療方案，而中醫(yī)治療在此階段展現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)。

支氣管擴(kuò)張?jiān)谥嗅t(yī)屬“咳嗽”“肺癰”“肺痿”等范疇。陳實(shí)功在《外科正宗·肺癰論》中，將肺癰分為初期、成膿期、潰膿期、恢復(fù)期四期進(jìn)行辨證論治[11]。現(xiàn)代醫(yī)家治療支氣管擴(kuò)張緩解期多從健脾、補(bǔ)肺、益腎等角度出發(fā)，兼顧祛痰逐瘀[12-14]。健脾祛濕化瘀膏由秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院研發(fā)，具有健脾益肺、祛濕化痰、活血通絡(luò)的功效，臨床用于支氣管擴(kuò)張緩解期的治療，效果頗佳[15]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用網(wǎng)絡(luò)整體觀來(lái)認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體之間相互作用的學(xué)科，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)健脾祛濕化瘀膏的有效化學(xué)成分進(jìn)行篩選，探索其治療支氣管擴(kuò)張緩解期的靶點(diǎn)基因及信號(hào)通路，進(jìn)而探討健脾祛濕化瘀膏的分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究中醫(yī)藥治療支氣管擴(kuò)張緩解期的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 健脾祛濕化瘀膏的化學(xué)成分篩選 首先對(duì)健脾祛濕化瘀膏的中藥組分進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后方中包括白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、冬瓜子、桃仁、藿香、防風(fēng)、砂仁、太子參、蘆根、薏苡仁、桔梗、萊菔子、化橘紅、秦艽共17味藥物。應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）對(duì)此17味中藥的有效成分進(jìn)行檢索，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)分別對(duì)每味中藥有效成分的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行篩選。其中OB包括生物利用程度和生物利用速度，是指藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的程度與速度；DL反映化合物中的特定功能基團(tuán)與已知藥物的相似性，二者對(duì)中藥化學(xué)成分活性的評(píng)估具有重要意義。

1.2 健脾祛濕化瘀膏與支氣管擴(kuò)張緩解期的共同靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP搜索健脾祛濕化瘀膏關(guān)鍵化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）查詢與靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的人類(lèi)基因名稱；再通過(guò)基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（genome annotation database platform，GeneCards）（https://www.genecards.org/）篩選出支氣管擴(kuò)張緩解期的疾病靶點(diǎn)基因，與藥物靶點(diǎn)信息進(jìn)行映射，得到藥物-疾病靶點(diǎn)基因及與之對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵化學(xué)成分。

1.3 關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)可視化 將藥物關(guān)鍵化學(xué)成分與藥物-疾病的共同靶點(diǎn)基因整理成為基因列表、化合物列表、網(wǎng)絡(luò)關(guān)系等文件，將上述文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)行圖像可視化處理，將關(guān)鍵化學(xué)成分與共同靶點(diǎn)基因之間的關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖的形式予以呈現(xiàn)。圖中節(jié)點(diǎn)表示關(guān)鍵化學(xué)成分和靶點(diǎn)，邊表示節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)反映蛋白間相互作用關(guān)系。將健脾祛濕化瘀膏與支氣管擴(kuò)張緩解期的共同靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/Version 10.5），研究物種選擇人類(lèi)（Homo sapiens），將PPI評(píng)分設(shè)為0.9，并隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。以不同顏色代表不同證據(jù)關(guān)系，下載PPI關(guān)系圖和關(guān)系數(shù)據(jù)，篩選出前10名PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通過(guò)Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查詢藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因的基因ID。采用Bioconductor平臺(tái)，分別設(shè)置P=0.05，P=0.05，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制柱狀圖，再運(yùn)用Cytoscape繪圖軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 健脾祛濕化瘀膏化學(xué)成分的篩選 利用TCMSP對(duì)健脾祛濕化瘀膏中所含的化學(xué)成分進(jìn)行檢索，并通過(guò)OB≥30%，DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共得到165個(gè)化學(xué)成分。見(jiàn)表1。

2.2 藥物-疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)TCMSP查詢健脾祛濕化瘀膏有效成分的靶點(diǎn)信息，通過(guò)Uniprot進(jìn)行基因ID注釋。通過(guò)GeneCards和人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳在線（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索支氣管擴(kuò)張緩解期的靶點(diǎn)基因，輸入“bronchodilator relief period”，獲得評(píng)分≥5的相關(guān)疾病靶點(diǎn)基因共224個(gè)，將藥物與疾病的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因共60個(gè)。見(jiàn)表2。記錄共同靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的健脾祛濕化瘀膏有效成分，最終得到健脾祛濕化瘀膏和支氣管擴(kuò)張緩解期的關(guān)鍵化學(xué)成分共107個(gè)。

2.3 藥物關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件將藥物-關(guān)鍵化學(xué)成分-疾病-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。見(jiàn)圖1。圖中矩陣代表靶點(diǎn)，圓圈代表關(guān)鍵化學(xué)成分，其中不同顏色代表化合物來(lái)源于不同的藥物。藥物活性成分的自由度以“degree”來(lái)表示，排名前5的關(guān)鍵化學(xué)成分為槲皮素（quercetin，MOL000098，degree=42）、 木犀草素（luteolin，MOL000006，degree=21）、 山奈酚（kaempferol，MOL000422，degree=20）、 尼泊爾鳶尾異黃酮（irisolidone，MOL005916，degree=15）、芒柄花黃素（formononetin，MOL000392，degree=13）。 排名前10的靶點(diǎn)蛋白為前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、90kDa熱休克蛋白αA1（heat shock protein HSP 90kDa αA1，HSP90AA1）、雌激素受體1（estrogen receptor1，ESR1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、PTGS1、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARG）、β-2腎上腺素受體（β-2 adrenergic receptor，ADRB2）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、 孕酮受體（progesterone receptor，PGR）。

表1-1 健脾祛濕化瘀膏的有效化學(xué)成分Tab.1-1 Effective chemical components of Jianpi Qushi Huayu ointment

表1-2 健脾祛濕化瘀膏的有效化學(xué)成分Tab.1-2 Effective chemical components of Jianpi Qushi Huayu ointment

表2 藥物-疾病靶點(diǎn)基因詳細(xì)信息Tab.2 Drug-disease target gene details

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將60個(gè)共同靶點(diǎn)基因相應(yīng)的蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，研究物種選擇人類(lèi)（Homo sapiens），獲取PPI并以評(píng)分＞0.9為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖2。該網(wǎng)絡(luò)包括60個(gè)節(jié)點(diǎn)、166條邊，通過(guò)計(jì)算每個(gè)基因連接節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，找出前10個(gè)核心基因，分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、 白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、HSP90AA1、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、MAPK14、MAPK3、STAT1、金屬蛋白酶抑制劑1（metalloproteinase inhibitor 1，TIMP1），這些即為健脾祛濕化瘀膏治療支氣管擴(kuò)張緩解期的核心基因。見(jiàn)圖2、3。

2.5 GO功能富集分析 GO主要包括生物過(guò)程（biological process，BP）、 細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三部分。 主要富集的BP包括營(yíng)養(yǎng)水平應(yīng)答（response to nutrient levels）、營(yíng)養(yǎng)應(yīng)答（response to nutrient）、氧化應(yīng)激應(yīng)答（response to oxidative stress）等。見(jiàn)圖4。富集的CC包括囊泡腔（vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、 細(xì)胞質(zhì)囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）等。見(jiàn)圖5。富集的MF包括血紅素結(jié)合（heme binding）、四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）等。 見(jiàn)圖6。

圖1 健脾祛濕化瘀膏關(guān)鍵化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The key chemical component-target network diagram of Jianpi Qushi Huayu ointment

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，健脾祛濕化瘀膏治療支氣管擴(kuò)張緩解期的主要通路包括晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路等。見(jiàn)圖7。

2.7 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape軟件將得到的通路和靶點(diǎn)信息繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)連接節(jié)點(diǎn)數(shù)目設(shè)定degree，形狀越大表示富集越顯著，網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)為MAPK1、MAPK3、MAPK14、JUN、IL6等。見(jiàn)圖8。

3 討論

健脾祛濕化瘀膏由秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院研發(fā)，成分包括白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、冬瓜子、桃仁、藿香、防風(fēng)、砂仁、太子參、蘆根、薏苡仁、桔梗、萊菔子、化橘紅、秦艽共17味中藥，其中茯苓、白術(shù)、太子參、薏苡仁益氣健脾、利水滲濕，陳皮、半夏、砂仁、冬瓜子理氣健脾、燥濕化痰，桃仁止咳平喘，防風(fēng)勝濕，藿香化濕，化橘紅理氣寬中、燥濕化痰，萊菔子降氣化痰、止咳平喘，秦艽祛風(fēng)濕、化瘀通絡(luò)，蘆根清熱透肺，全方共奏健脾祛濕化瘀之效。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

圖3 PPI核心基因Fig.3 PPI core genes

圖4 主要作用靶點(diǎn)BP條形圖Fig.4 The barplot chart of BP of main targets

圖5 主要作用靶點(diǎn)CC條形圖Fig.5 The barplot chart of CC of main targets

圖6 主要作用靶點(diǎn)MF條形圖Fig.6 The barplot chart of MF of main targets

圖8 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Target-pathway network

支氣管擴(kuò)張是由于持續(xù)的炎癥反應(yīng)所造成的氣道壁損害，有害的細(xì)胞因子發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激免疫細(xì)胞，其所釋放的蛋白酶和自由基會(huì)加重氣道損傷。本研究結(jié)果顯示，健脾祛濕化瘀膏所含的槲皮素、木犀草素、山奈酚、尼泊爾鳶尾異黃酮、芒柄花黃素等在與靶點(diǎn)基因的匹配中，具有較高的自由度。槲皮素屬于黃酮類(lèi)化合物，祛痰、止咳作用較強(qiáng)，還具有一定平喘作用，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)毛細(xì)血管張力，也可以作為抗氧化劑應(yīng)用于肺部疾病的治療中[16]。木犀草素是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)咳、祛痰作用，還能夠拮抗局部炎癥。研究提示木犀草素能明顯抑制TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子表達(dá)，影響核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的基因表達(dá)，還具有抗肺纖維化的藥理作用[17]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，抗菌活性良好，且能夠抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，從而達(dá)到抗炎效果；此外山奈酚還具有抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、增強(qiáng)胰島素敏感性等功效[18]。有研究證實(shí)，尼泊爾鳶尾異黃酮能夠明顯提高耐缺氧能力，并具有較強(qiáng)的擴(kuò)張微血管、降低血管阻力的作用[19]。芒柄花黃素對(duì)機(jī)體損傷具有保護(hù)作用，能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，幫助機(jī)體清除代謝廢物，并能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[20]。以上幾種化學(xué)成分均具有減輕炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)血管阻力的作用，有助于拮抗支氣管擴(kuò)張的炎癥反應(yīng)，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，減輕氣道的損傷。

本研究中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白有PTGS2、HSP90AA1、ESR1、AR、PTGS1、NOS2、PPARG、ADRB2、MAPK14、PGR等。PTGS2可將花生四烯酸酯轉(zhuǎn)化為前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2），上述過(guò)程是前列腺素合成的重要步驟，能夠產(chǎn)生炎性前列腺素，其上調(diào)與細(xì)胞粘附增加、表型改變和腫瘤血管生成有關(guān)[21]。HSP90AA1是一種分子伴侶，能夠促進(jìn)特定靶蛋白的成熟和結(jié)構(gòu)維持，并具有對(duì)細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。ESR1參與真核基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，并能影響靶組織中的細(xì)胞增殖和分化。AR是一種類(lèi)固醇激素受體，為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)真核基因表達(dá)，并影響靶組織中的細(xì)胞增殖和分化。PTGS1參與類(lèi)前列腺素的組成型生產(chǎn)，尤其是在胃和血小板中，該過(guò)程是前列腺素產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟，在細(xì)胞保護(hù)中起著重要作用。NOS2可合成一氧化氮（nitric oxide，NO），后者是具有多種功能的信使分子，NOS2還具有亞硝化酶活性，并能介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)靶蛋白的半胱氨酸S-亞硝基化[22]。PPARG能控制脂肪酸的過(guò)氧化物酶體β-氧化途徑，是脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。ADRB2屬于G蛋白偶聯(lián)受體1家族，可通過(guò)G蛋白的作用介導(dǎo)兒茶酚胺誘導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶激活[23]。MAPK14是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分，在細(xì)胞反應(yīng)級(jí)聯(lián)中起著重要作用[24]。PGR參與真核基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，并影響靶組織中的細(xì)胞增殖和分化。

本研究富集的信號(hào)通路有AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路在促炎癥反應(yīng)中起到非常重要的作用，其中RAGE在炎癥反應(yīng)中作為促炎性介質(zhì)[25]；TNF具有抑制細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)能夠抗感染、抑制病毒復(fù)制及病毒蛋白合成[26]；IL-17誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子能夠抑制炎癥基因的表達(dá)，IL-17信號(hào)通路則與自身免疫性疾病及癌癥的發(fā)病密切相關(guān)[27]?？梢?jiàn)健脾祛濕化瘀膏可能通過(guò)抗感染、抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等多種途徑對(duì)支氣管擴(kuò)張緩解期起到治療作用。

綜上所述，本研究探索出健脾祛濕化瘀膏治療支氣管擴(kuò)張緩解期的關(guān)鍵化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及作用信號(hào)通路，并對(duì)健脾祛濕化瘀膏治療支氣管擴(kuò)張緩解期多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜作用機(jī)制進(jìn)行了探討，為未來(lái)更廣泛的臨床應(yīng)用提供了理論支撐。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)目前存在數(shù)據(jù)庫(kù)不完善、對(duì)藥材成分認(rèn)識(shí)存在差異的問(wèn)題，故在藥物的認(rèn)識(shí)研究、新藥預(yù)測(cè)方面仍存在著局限性，需要更深層次的研究加以佐證。