米根霉發(fā)酵米糠工藝優(yōu)化及其益生活性研究

張夏秋 劉麗婭 王麗麗 佟立濤 周閑容 周素梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

米糠是稻谷加工的主要副產(chǎn)物之一，由果皮、種皮、珠心層和糊粉層等組成，占稻谷總質(zhì)量的8%～10%[1]，我國米糠平均年產(chǎn)量約1 200萬t[2]。米糠含有米糠多糖、蛋白質(zhì)、膳食纖維、B族維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[3]，還富含γ-氨基丁酸、酚酸、類黃酮等生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)血壓、抗疲勞、抗氧化、預(yù)防人體心腦血管疾病等方面具有一定功效，是開發(fā)功能性食品的理想原料[4]。目前，國外對米糠的研究開發(fā)比國內(nèi)領(lǐng)先，在保存米糠資源和綜合利用上已取得較大進(jìn)展，大量以米糠為原料的可食用產(chǎn)品被開發(fā)利用并取得了不錯的經(jīng)濟(jì)效益[5]。然而在國內(nèi)，米糠大多用作飼料，少部分被用于提取米糠油后直接丟棄，導(dǎo)致大部分營養(yǎng)成分未得到充分利用，造成資源的極大浪費(fèi)[6]。

米糠油脂含量較高，穩(wěn)定性差，易哈敗變質(zhì)，為保證充分利用米糠資源并對其進(jìn)行后續(xù)深加工，必須首先采取快速有效的方式對新鮮米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理，抑制其酸敗。通過發(fā)酵提高米糠中可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)含量來改善穩(wěn)定化米糠的口感風(fēng)味[7]，提高米糠的營養(yǎng)功能特性。研究表明，黑曲霉發(fā)酵可有效提高米糠粕中SDF含量[8]；納豆芽孢桿菌發(fā)酵能顯著提高小米糠中膳食纖維的溶脹性，從而改善小米糠的生理特性[9]；采用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B4發(fā)酵米糠粕，SDF得率顯著提高[10]。在米根霉發(fā)酵米糠研究領(lǐng)域，一方面集中在功能活性的研究如抗氧化活性變化等[11]，另一方面主要是成分變化研究如蛋白質(zhì)、脂肪酸等含量的變化[12]。然而有關(guān)米根霉發(fā)酵條件對SDF得率的影響及米根霉發(fā)酵前后米糠益生活性的變化尚鮮見報(bào)道。因此，本研究采用過熱蒸汽對米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理，然后選取3種米根霉作為發(fā)酵菌種，以SDF得率和感官評分為指標(biāo)，篩選最佳發(fā)酵菌種，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定米根霉發(fā)酵米糠的最佳工藝，并對發(fā)酵前后米糠的益生活性進(jìn)行評價，以期為改善食用米糠產(chǎn)品質(zhì)量，提高米糠功能特性以及今后米糠在發(fā)酵方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為開發(fā)新型米糠功能食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，黑龍江金都稻米公司當(dāng)季稻谷所碾新鮮米糠，過40目篩；3種米根霉(酒香型、甜香型、風(fēng)味型)，安琪酵母股份有限公司；α-淀粉酶(15 U·mg-1)、胃蛋白酶(474 U·mg-1)、胰酶(4×USP)，美國Sigma公司；豬膽汁，北京索萊寶生物有限公司；蛋白胨，奧博星生物技術(shù)有限公司；酵母膏、胰蛋白胨，英國Oxoid公司；2XSG PCR MasterMix，美國Applied Biosystems公司；95%乙醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂等均為分析純，國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TABLE-TOP 350型過熱蒸汽烤制設(shè)備，日本Naomoto公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LGI-25C冷凍干燥機(jī)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UT-760厭氧發(fā)酵罐，廣州市尤德生物科技有限公司；ABI 7500實(shí)時定量PCR儀，美國Perkin Elmer公司；78900B氣相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FW100高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠穩(wěn)定化條件優(yōu)化 采用過熱蒸汽設(shè)備對米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理。米糠于55℃烘干，隨機(jī)分為3組，每組3份，每份100.0 g，平鋪于不銹鋼盤中。將裝有米糠樣品的不銹鋼盤迅速放入設(shè)定溫度處理室(過熱蒸汽處理器)，且處理室溫度變化不超過1℃，并開始計(jì)時。處理設(shè)定溫度分別為120、140、160℃，每個溫度下分別處理1、2、3 min。樣品處理完畢后測定其脂肪酶活力，確定最佳穩(wěn)定化溫度和時間。

1.3.2 脂肪酶活力測定 參照GB/T 5523-2008[13]，采用滴定法測定米糠脂肪酶活力。

1.3.3 米根霉發(fā)酵米糠菌種篩選 3種米根霉固定料液比1∶2.0、發(fā)酵溫度35℃，接種量0.5%，分別發(fā)酵24、36、48、60、72 h。取20.0 g最佳穩(wěn)定化條件處理后的米糠于250 mL錐形瓶中，加入一定量的無菌水?dāng)嚢杈鶆?，加入耐高溫?淀粉酶，于121℃滅菌20 min，冷卻至室溫后接種，置于振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵(轉(zhuǎn)速180 r·min-1)， 發(fā)酵完成后，121℃滅菌20 min，冷凍干燥后用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，裝于自封袋，置于-20℃儲存?zhèn)溆谩Ｃ拷M試驗(yàn)設(shè)3個平行。

1.3.4 米糠SDF提取及得率測定 參照王旭等[14]的方法提取米糠SDF。分別稱取2.0 g米糠樣品，按1∶50(g·mL-1)的料液比加入蒸餾水，沸水浴攪拌40 min，冷卻至室溫后，加入200 μL耐高溫α-淀粉酶，調(diào)節(jié)pH值至中性后進(jìn)行酶解。105℃加熱15 min滅酶后冷卻至室溫。之后加入50 mL 1.12%(m∶v)NaOH溶液，攪拌均勻后置于80℃水浴鍋中反應(yīng)60 min。取出后冷卻至室溫，4 000 r·min-1離心20 min后取上清液，用4倍體積95%乙醇沉淀，4 000 r·min-1離心10 min，將所得沉淀物真空干燥后得到SDF，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用GB/T 5009.88-2014[15]測定膳食纖維(dietary fiber，DF)，并根據(jù)公式計(jì)算SDF得率：

(1)

式中，m1為烘干至恒重時米糠干物質(zhì)中SDF的質(zhì)量，g；m0為米糠干物質(zhì)中DF的質(zhì)量，g。

1.3.5 發(fā)酵米糠的感官評價 選擇10名從事食品專業(yè)的人員組成評定小組，分別從質(zhì)地、色澤、氣味、酸甜度及風(fēng)味5個方面對發(fā)酵米糠的感官品質(zhì)進(jìn)行評價。在評價過程中，要求評定小組人員客觀公正，并充分領(lǐng)會各項(xiàng)評價指標(biāo)的含義。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分(表1)，結(jié)果取平均值。

1.3.6 米根霉發(fā)酵米糠工藝條件優(yōu)化 以米根霉最佳發(fā)酵菌種進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。

1.3.6.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 發(fā)酵溫度35℃、接種量0.5%、料液比1∶2.0、發(fā)酵時間36 h，固定三個基礎(chǔ)條件，改變其中一個條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。料液比(m:v)(1∶0.50、1∶1.00、1∶1.50、1∶2.00、1∶2.25、1∶2.50)、接種量(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%)、發(fā)酵時間(24、36、48、60、72 h)、發(fā)酵溫度(25、30、35、40℃)，測定不同條件下發(fā)酵米糠SDF得率。

1.3.6.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)發(fā)酵菌種的篩選結(jié)果及單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為試驗(yàn)因素，以SDF得率為指標(biāo)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用L16(45)正交表(表2)，每組重復(fù)3次，取平均值。

1.3.7 發(fā)酵米糠的體外消化及模擬腸道發(fā)酵 (1)體外消化：參照 Connolly等[16]和Guergoletto等[17]的方法，并略作修改。準(zhǔn)確稱取12.00 g米糠樣品(最佳發(fā)酵工藝條件下所得米糠樣品)于250 mL錐形瓶中，加入200 mL 無菌水?dāng)嚢杈鶆?，隨后加入1.25 mL含有10.00 mg唾液α-淀粉酶的CaCl2溶液(1 mmol·L-1，pH值7.0)，空白組不加米糠，置于37℃恒溫水浴振蕩反應(yīng)，消化15 min后，用HCl溶液(6 mol·L-1) 調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至 2.0，繼續(xù)加入5 mL溶有0.24 g胃蛋白酶的HCl溶液(0.1 mol·L-1)，置于37℃恒溫水浴振蕩反應(yīng)；消化2 h后，用NaOH溶液(6 mol·L-1) 調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至6.8，繼續(xù)加入10 mL溶有0.22 g胰酶和0.70 g膽汁的NaHCO3溶液(0.5 mol·L-1)， 置于37℃恒溫水浴振蕩搖床反應(yīng)，消化4 h后，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至1 kDa透析袋中透析24 h。最后將消化液冷凍干燥(-40℃，8.33 Pa)，置于-20℃保存，用于模擬腸道發(fā)酵試驗(yàn)。

表1 發(fā)酵米糠感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of fermented rice bran

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal test

(2)人體糞便樣品制備：用無菌采樣袋和滅菌藥匙收集5名年齡為23～27歲健康志愿者的新鮮糞便樣品，所有志愿者身體狀況良好，且在試驗(yàn)前至少6個月內(nèi)未使用過抗生素。將糞便樣品等量均勻混合后，立即用已滅菌的1 mmol·L-1pH 值7.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)按照 1∶5的比例(m∶v) 進(jìn)行稀釋。

(3)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制：參考Ramnani等[18]和胡婕倫[19]的方法，并略作修改?；A(chǔ)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分配比：4.5 g·L-1NaCl、0.01 g·L-1MgSO4·7H2O、0.01 g·L-1CaCl2、2.5 g·L-1KCl、2 g·L-1NaHCO3、0.04 g·L-1K2HPO4、0.04 g·L-1KH2PO4、3 g·L-1蛋白胨、3 g·L-1胰蛋白胨、4.5 g·L-1酵母膏、10 μL·L-1維生素K1、0.5 g·L-1膽鹽3號、0.5 g·L-1L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.05 g·L-1氯高鐵血紅素、2 mL·L-1吐溫80。上述所有成分溶解后，將pH值調(diào)至7.0并滅菌(120℃，20 min)，備用。

(4)體外模擬腸道發(fā)酵：參考Guergoletto等[17]的方法，并略作修改。采用嚴(yán)格厭氧條件，向已滅菌的發(fā)酵瓶中加入40 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基和5 mL糞便稀釋液，然后加入凍干后的米糠消化產(chǎn)物使其最終含量為 2%(m∶v)，渦旋混勻，充入N21 min后封口。將所有發(fā)酵瓶放入?yún)捬醢l(fā)酵罐，于37℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，取3 mL發(fā)酵液測定腸道菌群數(shù)量和短鏈脂肪酸含量。從糞便采集至開始發(fā)酵盡量在30 min內(nèi)完成。陽性對照組中加入等量菊粉，空白組中不添加碳源。

1.3.8 腸道菌群數(shù)量測定 利用實(shí)時熒光定量PCR檢測腸道菌群數(shù)量，測定發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌和腸桿菌數(shù)量[20]。取3 mL發(fā)酵24 h的發(fā)酵液，11 000 r·min-1離心20 min，沉淀物用于檢測發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌及擬桿菌數(shù)量。根據(jù)雙歧桿菌、乳酸桿菌[21]、擬桿菌和腸桿菌[17]16S rDNA 基因序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，取標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA和發(fā)酵液樣品DNA進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，檢測引物特異性。

表3 實(shí)時熒光定量PCR引物序列Table 3 Primer sequence of quantitative real-time PCR

1.3.9 短鏈脂肪酸(short chain fatty acid, SCFA)含量測定 參照倪香艷[22]的方法。取3 mL發(fā)酵24 h后的發(fā)酵液，40℃、11 000 r·min-1離心20 min后，收集上清液用于短鏈脂肪酸含量測定。

氣相色譜條件：色譜柱：DB-FFAP(15 cm×0.32 mm×0.25 μm)；柱溫：100℃，2℃·min-1升溫至120℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：280℃；恒壓：21.8 kPa；分流比：1∶50；進(jìn)樣量：2 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；采用Origin 9.0 制圖；采用單因素方差分析顯著性(Duncan′s multiple range test)，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 過熱蒸汽穩(wěn)定化米糠結(jié)果分析

由圖1可知，當(dāng)過熱蒸汽處理時間相同時，隨著溫度升高，米糠脂肪酶失活率呈上升趨勢；且隨著處理時間的延長，相同處理溫度下米糠脂肪酶失活率呈上升趨勢。當(dāng)過熱蒸汽處理溫度為160℃、處理時間為2 min時，米糠脂肪酶失活率達(dá)到最高，為88.01%。綜上，過熱蒸汽160℃處理2 min為米糠穩(wěn)定化的最佳條件。

圖1 過熱蒸汽處理對米糠脂肪酶活力的影響Fig.1 Effect of superheated steam treatment on lipase activity of rice bran

2.2 菌種篩選結(jié)果分析

由圖2可知，3種菌種經(jīng)不同發(fā)酵時間后米糠SDF得率存在明顯差異。在24、36、48和60 h發(fā)酵時段，甜香型菌種的米糠SDF得率最高，且在發(fā)酵48 h時達(dá)到最高值，為4.66%。在36、48 60 h發(fā)酵時段，酒香型菌種的米糖SDF得率僅次于甜香型菌種，其最高為4.47%。表明酒香型和甜香型菌種發(fā)酵米糠SDF得率高于風(fēng)味型菌種。

圖2 菌種類型對發(fā)酵米糠產(chǎn)物SDF得率的影響Fig.2 Effect of strain type on SDF yield of fermented rice bran

由圖3可知，酒香型和甜香型菌種發(fā)酵的米糠感官總分較高，其中甜香型菌種發(fā)酵的米糠經(jīng)48 h發(fā)酵后，其感官評價總分最高(90.0)；風(fēng)味型菌種經(jīng)72 h發(fā)酵后米糖感官總分最低，為65.0分。由圖4經(jīng)發(fā)酵48 h后米糖感官評分可知，不同菌種發(fā)酵的米糠在色澤、質(zhì)地方面的差異較小，在氣味、酸甜度及風(fēng)味等方面的差異較大。綜上，甜香型菌種發(fā)酵米糠在氣味、酸甜度和風(fēng)味等方面評分均最高，其次為酒香型菌種。因此，選取甜香型米根霉作為米糠最佳發(fā)酵菌種進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 菌種類型對發(fā)酵米糠感官總分的影響Fig.3 Effect of strain type on sensory total score of fermented rice bran

圖4 菌種類型對發(fā)酵米糠各項(xiàng)感官分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of strain type on the sensory components of fermented rice bran

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 料液比對米糠SDF得率的影響 由圖5可知，當(dāng)料液比小于1∶2.25時，隨著加水量的增加，米糖SDF得率升高，當(dāng)料液比為1∶2.25時，米糠SDF得率達(dá)到最高，繼續(xù)增加料液比，米糠SDF得率降低。這可能與米根霉發(fā)酵時對底物的含水量有一定要求相關(guān)，加水量過少會導(dǎo)致菌體與底物接觸不充分，導(dǎo)致發(fā)酵不夠徹底；當(dāng)含水量達(dá)到一定程度后，繼續(xù)提高料液比，發(fā)酵底物逐漸被稀釋，且米糠吸水膨脹，導(dǎo)致底物透氣性下降，從而影響發(fā)酵效果[23]。本試驗(yàn)中，料液比為1∶2.00的米糠SDF得率與料液比1∶2.25無顯著差異。因此考慮米糠發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)節(jié)約性，確定米根霉發(fā)酵米糠最適料液比為1∶2.00。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖5 料液比對米糠SDF得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on SDF yield of rice bran

2.3.2 接種量對米糠SDF得率的影響 由圖6可知，當(dāng)米根霉接種量低于0.50%時，隨著接種量的增加，米糖SDF得率顯著增加，這可能是由于米根霉發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶增加，將更多的不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)降解為小分子多糖所致；當(dāng)米根霉接種量大于0.50%時，米糖SDF得率未顯著增加，這可能是因?yàn)楫?dāng)接種量繼續(xù)增加時，米根霉菌體生長旺盛，菌體之間相互競爭激烈，導(dǎo)致底物中營養(yǎng)物質(zhì)不足，致使菌體發(fā)酵能力降低[24]。因此，確定米根霉發(fā)酵米糠最佳接種量為0.50%。

2.3.3 發(fā)酵時間對米糠SDF得率的影響 由圖7可知，隨著米根霉發(fā)酵時間的延長，米糠SDF得率整體呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間大于36 h時，米糠SDF得率增加緩慢，當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，米糠SDF得率最高，隨后SDF得率開始下降。這可能是由于米糠經(jīng)48 h發(fā)酵后，底物中的營養(yǎng)物質(zhì)等被消耗，不足以維持菌體生長，導(dǎo)致米根霉發(fā)酵能力降低，產(chǎn)酶能力下降[8]；此外，隨著發(fā)酵時間的延長，底物pH值逐漸降低，也可能會影響菌體生長。因此，確定米根霉發(fā)酵米糠最適時間為36 h。

圖7 發(fā)酵時間對米糠SDF得率的影響Fig.7 Effect of fermentation time on SDF yield of rice bran

2.3.4 發(fā)酵溫度對米糠SDF得率的影響 由圖8可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，米糠SDF得率逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時，米糠SDF得率最高，為4.75%。這可能是因?yàn)闇囟冗^低時，菌體生長緩慢，產(chǎn)酶能力降低；而適當(dāng)?shù)母邷啬軌虼龠M(jìn)菌體的生長，其釋放的酶類活性也相應(yīng)升高，致使米糠SDF得率上升。但考慮到米根霉發(fā)酵的最適溫度，最終確定米根霉發(fā)酵米糠最適溫度為35℃。

圖8 發(fā)酵溫度對米糠SDF得率的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on SDF yield of rice bran

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表4、5可知，米糠SDF得率的極差分析得到影響米糠SDF得率因素的主次排序：B>C>A>D，最佳發(fā)酵條件：料液比1∶2.25、接種量0.7%、35℃下發(fā)酵24 h；感官總分的極差分析得到影響米糠SDF得率因素的主次排序：B>C>D>A，最佳發(fā)酵條件：料液比1∶1.00、接種量0.5%、35℃下發(fā)酵36 h。綜合考量，選取最優(yōu)組合為A4B4C1D3，即各因素最優(yōu)水平為料液比1∶2.25、接種量0.7%、35℃和24 h發(fā)酵。

2.5 發(fā)酵米糠腸道益生活性結(jié)果分析

2.5.1 腸道菌群數(shù)量分析 雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌對保持宿主腸道正常微生態(tài)環(huán)境具有非常重要的作用。由圖9可知，在最佳發(fā)酵工藝條件下，米糠消化產(chǎn)物經(jīng)體外24 h發(fā)酵后，發(fā)酵米糠添加組雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的對數(shù)值分別為6.85和5.23，顯著低于陽性對照組(菊粉組)；與陰性對照組(空白組24 h)相比，未發(fā)酵米糠添加組與發(fā)酵米糠添加組的擬桿菌數(shù)量均顯著降低，且發(fā)酵米糠添加組顯著低于未發(fā)酵米糠添加組。腸桿菌是腸道中常見的致病菌[25]。體外發(fā)酵24 h期間，與陰性對照組(空白組24 h)相比，發(fā)酵米糠添加組與未發(fā)酵米糖添加組體外發(fā)酵液中腸桿菌數(shù)量均明顯升高，且發(fā)酵米糠添加組對腸桿菌的抑制作用明顯優(yōu)于未發(fā)酵米糠添加組。表明經(jīng)甜香型米根霉發(fā)酵后的米糠，在維持腸道健康方面的效果顯著優(yōu)于未發(fā)酵米糠。

注：不同小寫字母表示同一菌不同組之間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference between the same bacteria in different groups at 0.05 level.圖9 米糠體外消化產(chǎn)物腸道菌群數(shù)量分析Fig.9 Analysis of intestinal flora of rice bran digesting products in vitro

2.5.2 SCFAs含量分析 碳水化合物在腸道中經(jīng)腸道菌發(fā)酵后會產(chǎn)生代謝終產(chǎn)物CFAs[26]。SCFAs作為宿主的能量來源，有利于維持宿主健康的腸道微生態(tài)環(huán)境[27]。由表6可知，體外發(fā)酵24 h后，與陰性對照組(空白組24 h)相比，發(fā)酵米糠添加組發(fā)酵液中的乙酸、丙酸、丁酸含量均顯著升高，發(fā)酵米糠添加組和未發(fā)酵米糠添加組對SCFAs總量的促進(jìn)作用均顯著高于陽性對照組(菊粉)，且發(fā)酵米糠添加組的發(fā)酵液中SCFAs總量顯著高于未發(fā)酵米糠添加組。表明，甜香型米根霉發(fā)酵米糠與未發(fā)酵米糠對SCFAs含量均有顯著影響，前者對SCFAs含量的促進(jìn)作用更明顯。

表4 米根霉發(fā)酵米糠正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test of hizopus oryzae fermenting rice bran

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance

表6 米糠體外消化產(chǎn)物短鏈脂肪酸含量分析Table 6 Analysis of short-chain fatty acids content ofrice bran digesting products in vitro /(mmol·L-1)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)采用過熱蒸汽對米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理，隨著處理溫度的升高及處理時間的延長，脂肪酶活力逐漸降低，當(dāng)米糠經(jīng)過熱蒸汽160℃處理2 min時，脂肪酶失活率達(dá)到最高，為88.01%，繼續(xù)延長處理時間并不能使脂肪酶失活率繼續(xù)上升。這是由于部分脂溶性酶類的耐熱性極強(qiáng)，很難鈍化，如磷脂酶、糖酶以及酯酶等[28]。胡迪[29]采用過熱蒸汽160℃處理米糠2 min，其脂肪酶的失活率為86.59%，與本研究結(jié)果類似。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度繼續(xù)升高會導(dǎo)致米糠變焦黃色，同時米糠特有香味變淡，且溫度過高造成能耗大幅度增加。

本研究以發(fā)酵米糠的SDF得率和感官評分為指標(biāo)，從酒香型、甜香型、風(fēng)味型3種米根霉菌種中篩選出甜香型米根霉為最佳發(fā)酵菌種，根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳發(fā)酵條件為甜香型米根霉為發(fā)酵菌種，料液比為1∶2.25，接種量0.7%、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間24 h，此條件下SDF得率為5.83%。

研究表明谷物在體內(nèi)外對腸道微生態(tài)具有良好的調(diào)節(jié)作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)酵米糖相比，發(fā)酵米糠對雙歧桿菌和乳酸桿菌均有顯著的增殖效果，本研究還發(fā)現(xiàn)，米糠能夠促進(jìn)腸道益生菌產(chǎn)生SCFAs，且促進(jìn)效果顯著高于陽性對照組(菊粉)，同時經(jīng)米根霉發(fā)酵米糠的促進(jìn)作用顯著高于未發(fā)酵米糠。Arcila等[30]以麥麩為原料通過體外厭氧發(fā)酵24 h發(fā)現(xiàn)SCFAs含量增加1.4倍；Saya等[31]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵米糠與未發(fā)酵米糠對小鼠腸道菌群有不同程度的影響；張媛等[32]報(bào)道雙歧桿菌能夠?qū)⒚撝∶卓纷鳛樘荚醇右岳?，從而促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖；Junna等[33]發(fā)現(xiàn)米糠能夠促進(jìn)乳酸桿菌的生長，上述研究均與本研究結(jié)果一致。這可能是由于米糠經(jīng)米根霉發(fā)酵后將更多的不可溶膳食纖維降解轉(zhuǎn)化為可溶膳食纖維，更有利于雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌的利用；同時發(fā)酵改性后的米糠，可顯著提高體外發(fā)酵過程中有機(jī)酸的含量，從而降低腸道pH值，在一定程度上抑制腸桿菌的生長。

4 結(jié)論

本研究通過對米根霉發(fā)酵米糠工藝優(yōu)化確定了最佳發(fā)酵條件為：料液比1∶2.25、接種量0.7%、發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時間24 h，在此條件下，米糠SDF得率為5.83%，比發(fā)酵前提高了近一半。另外，通過甜香型米根霉發(fā)酵米糠與未發(fā)酵米糠的對比發(fā)現(xiàn)，米根霉發(fā)酵米糠的腸道益生活性顯著增強(qiáng)，可有效促進(jìn)雙歧桿菌(對數(shù)值6.85)和乳酸桿菌(對數(shù)值5.23)的增殖；且總短鏈脂肪酸含量顯著提高。本研究為米糠的加工提供了指導(dǎo)，通過米根霉發(fā)酵的米糠可作為一種有潛力的功能性配料用于食品中，對今后米糠在發(fā)酵方面的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。