薄殼山核桃幼苗對干旱脅迫的生理生化響應(yīng)

李劍威 晏舒蕾 黃元城 夏曉雪 儲凌峰 李財運 王正加

(浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 311300)

干旱是全球作物生產(chǎn)力面臨的最嚴重威脅之一[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國干旱、半干旱地區(qū)的面積已達到土地總面積的47%，耕地面積中干旱、半干旱地區(qū)占51%，且在其他大部分地區(qū)也經(jīng)常發(fā)生不定期的氣候干旱[2-3]。薄殼山核桃(Caryaillinoensis)，又名美國山核桃、長山核桃[4]，是重要的經(jīng)濟干果樹種[5]，也是重要的用材和綠化樹種[6]，具有經(jīng)濟、生態(tài)和社會的綜合效益[7]，主要分布在江蘇、浙江、安徽、云南、陜西、福建、江西和湖南等地區(qū)[8-9]。薄殼山核桃若在生長過程中遭遇干旱脅迫，其生長量和商品性會降低，因此薄殼山核桃能夠?qū)μ囟ǖ淖匀画h(huán)境條件做出適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)已成為其進一步推廣和種植的重要前提。

目前，關(guān)于干旱脅迫對木本植物生理生化指標影響的研究多集中于楊樹[10-11]和桑樹[12-13]。研究表明，紫仁核桃會通過增強其葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性來響應(yīng)干旱脅迫[14]；新疆野核桃幼苗在干旱脅迫下，其葉片的可溶性糖(soluble sugar，SS)、可溶性蛋白(soluble protein，SP)和游離脯氨酸(proline，Pro)含量均呈上升趨勢[15]；胡楊葉片氣孔密度會隨著干旱脅迫程度的增加呈上升趨勢[16]，但有關(guān)薄殼山核桃幼苗對干旱脅迫生理生化響應(yīng)的相關(guān)研究鮮有報道。為此，本試驗采用盆栽試驗研究干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗的生理生化特性的影響，旨在探究薄殼山核桃幼苗的需水規(guī)律及耐旱機制，為薄殼山核桃人工栽培及推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

供試材料為大小一致、生長健壯的一年生實生薄殼山核桃幼苗(平均株高63.7 cm，平均地徑15.2 mm)。幼苗盆栽容器為34 cm×29 cm×23 cm(外口直徑×內(nèi)口直徑×高)的塑料花盆(帶托盤)，每盆裝土12.0 kg。所用土壤均為田園土，盆栽土壤的理化性質(zhì)為pH值5.5，速效鉀、有效磷、堿解氮含量分別為95.07、50.00、120.43 mg·kg-1，有機質(zhì)占比為2.74%，田間持水量為28.73%。

試驗地位于浙江農(nóng)林大學(xué)果木園(30°15′N，119°43′E)，該地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均降水量1 613.9 mm，降水日158 d，無霜期年平均為237 d，年平均氣溫16℃。

1.2 試驗方法

栽植苗木后正常供水管理，緩苗生長3個月。2018年7月1日正式開始干旱脅迫試驗。參照Hsiao[17]的方法，本試驗共設(shè)置4個土壤水分梯度處理：1)正常水分處理(CK)，土壤水分含量為田間持水量的75% ± 5%；2)輕度干旱脅迫(light drought，LD)，土壤水分含量為田間持水量的55% ± 5%；3)中度干旱脅迫(moderate drought，MD)，土壤水分含量為田間持水量的35% ± 5%；4)重度干旱脅迫(severe drought，SD)，土壤水分含量為田間持水量的15% ± 5%。每個處理3個平行，每個平行3個重復(fù)，共36株。試驗期間，每天18:00采用稱重法適當補水(補充自然流失水分)。干旱脅迫處理后第20、第50天取相同的無病蟲害的成熟葉片，于自然光下測定光合參數(shù)；并取無病害的葉片用液氮速凍后-80℃保存，用于抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和葉綠素含量的測定；待生理生化指標測定結(jié)束后，即干旱脅迫處理后第60天時，對生長指標差異明顯的CK和MD兩組進行采樣，每個處理各3株，在每株樹冠同方位、同部位采取健康成熟的葉片，葉片以主脈中部為中心，切成1 mm×3 mm×1 mm大小，戊二醛固定，抽真空，4℃保存，用于觀察葉片超微結(jié)構(gòu)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定 根據(jù)《測定土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[18]，分別采用電位法、乙酸銨提取法、鹽酸-乙酸銨法、堿解擴散法和高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法測定pH值、速效鉀含量、有效磷含量、堿解氮含量和有機質(zhì)含量。

1.3.2 葉綠素含量測定 采用乙醇浸泡的方法提取薄殼山核桃的葉綠素，并用UV-2600分光光度計(日本島津)測定葉綠素a和葉綠素b含量[19]。

1.3.3 光合參數(shù)測定 于晴朗天氣的上午9:00-11:00， 采用LI-6800便攜式光合測量系統(tǒng)(美國LI-COR公司)測定葉片的光合參數(shù)，包括凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)，氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)，蒸騰速率(transpiration rate，Tr)和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)。

1.3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定 參照馮芳芳等[20]的方法，采用茚三酮比色法測定Pro含量，采用考馬斯亮藍G-250染色法測定SP含量。

1.3.5 抗氧化酶活性和丙二醛含量測定 參照殷東生等[21]的方法，采用氮藍四唑(nitro-blue-terazolium, NBT)光還原法測定SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活性。參照王軍娥等[22]的方法，采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.6 超微結(jié)構(gòu)觀察 取樣品葉片經(jīng)戊二醛和鋨酸溶液雙固定后，采用Hitachi SU-8010型掃描電鏡(日立高新技術(shù)公司)對葉片表皮氣孔結(jié)構(gòu)進行觀察，每個處理葉片正反面各觀察10個視野并拍照；并用Hitachi H-7650型透射電鏡(日立高新技術(shù)公司)對細胞結(jié)構(gòu)以及葉綠體超微結(jié)構(gòu)進行觀察，超薄切片每個處理觀察10個視野并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)均用均值±標準誤差表示，利用SPSS 17.0分析軟件中的Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。采用GraphPad Prism 5.01軟件制圖，Microsoft Excel 2007軟件制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗生長的影響

SD的薄殼山核桃幼苗在處理后7 d，葉片出現(xiàn)嚴重萎蔫，試驗終止。干旱脅迫后50 d，薄殼山核桃幼苗的生長情況在不同干旱脅迫程度下表現(xiàn)出一定的差異(表1)，CK及LD幼苗生長良好，MD幼苗生長受到抑制，葉片出現(xiàn)枯黃脫落現(xiàn)象。其中，LD幼苗的株高最高(110.33 cm)且地徑最粗(22.75 mm)，CK的株高和地徑較MD分別增加了12.14%、7.29%。結(jié)果表明，薄殼山核桃幼苗在中度及重度干旱脅迫條件下株高和地徑生長受到明顯抑制，幼苗出現(xiàn)落葉現(xiàn)象。

表1 干旱脅迫后50 d薄殼山核桃幼苗生長情況Table 1 Growth of pecan seedlings after 50 days of drought stress

2.2 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片葉綠素含量的影響

由圖1-A可知，葉綠素a含量隨著干旱脅迫時間的延長呈下降趨勢，干旱脅迫50 d時，LD和MD的葉綠素a含量分別較干旱脅迫20 d時下降了42.32%、47.37%；在干旱脅迫50 d時，CK顯著高于LD和MD，其含量分別是LD和MD的1.22和1.35倍。由圖1-B可知，在干旱脅迫50 d時，CK與LD、MD的葉綠素b含量差異不顯著，而LD與MD的葉綠素b含量較干旱脅迫20 d時分別下降了16.00%和39.54%，且干旱脅迫50 d時，LD的葉綠素b含量最高，達到1.14 mg·g-1。 結(jié)果表明，干旱脅迫50 d時，隨著脅迫強度的增加，薄殼山核桃幼苗葉片的葉綠素含量總體上呈遞減的趨勢。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among treatment. The same as following.圖1 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of drought stress on chlorophyll content in leaves of pecan seedlings

2.3 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片光合參數(shù)的影響

薄殼山核桃幼苗葉片的Pn、Gs和Tr的變化規(guī)律基本一致，即隨著干旱脅迫程度增加而逐漸下降(圖2-A、B、C)，干旱脅迫50 d時，LD和MD的Pn、Gs、Tr分別較CK下降了17.16%和58.42%、61.47%和85.68%、37.96%和68.01%。而CK、LD和MD的Ci差異不顯著(圖2-D)。表明薄殼山核桃幼苗葉片的Pn、Gs和Tr均受到了干旱脅迫的影響，中度干旱脅迫對光合參數(shù)的影響最大。

2.4 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖3可知，在干旱脅迫20 d時，薄殼山核桃幼苗葉片的SP和Pro含量在各水分梯度下差異不顯著；在干旱脅迫50 d時，隨著干旱脅迫程度的加劇，SP含量和Pro含量均呈逐漸上升趨勢，LD和MD的SP含量分別較CK顯著增加141.68%和204.17%，MD的Pro含量較CK顯著增加了61.15%。表明薄殼山核桃幼苗會通過提高可溶性蛋白和脯氨酸含量來應(yīng)對干旱脅迫。

2.5 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片MDA含量和抗氧化酶活性的影響

由圖4-A、B可知，在干旱脅迫50 d時，隨著干旱脅迫程度的增加，薄殼山核桃幼苗葉片的MDA含量和SOD活性均呈逐漸上升趨勢。LD與MD的MDA含量分別較CK顯著增加165.09%和204.69%；SOD活性在MD達到峰值(367.93 U·mg-1prot)，較CK顯著增加了37.24%。由圖4-C、D可知，在干旱脅迫50 d時，隨著干旱脅迫程度的增加，薄殼山核桃幼苗葉片CAT活性呈下降趨勢，LD和MD的CAT活性較CK分別顯著下降了58.39%和59.72%。干旱脅迫50 d時，LD和MD的葉片POD活性較干旱脅迫20 d分別下降了13.48%和23.44%。結(jié)果表明，薄殼山核桃幼苗在干旱脅迫下活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多，引發(fā)脂質(zhì)過氧化,MDA含量升高，同時，幼苗會通過提高SOD活性來增強細胞消除ROS的能力。

圖2 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片光合參數(shù)的影響Fig.2 Effect of drought stress on photosynthetic parameters of leaves of pecan seedlings

圖3 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of drought stress on the content of osmotic adjustment substances in leaves of pecan seedlings

2.6 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片氣孔結(jié)構(gòu)及數(shù)量的影響

對比CK和MD，在薄殼山核桃幼苗葉片上表面均未發(fā)現(xiàn)氣孔，僅在下表面出現(xiàn)氣孔(圖5-A、B)；氣孔形態(tài)在干旱脅迫下較CK出現(xiàn)差異，CK呈正常開放狀態(tài)，且開張程度較大，保衛(wèi)細胞形態(tài)趨于飽滿(圖5-C)；而MD呈閉合狀態(tài)，氣孔閉合形式是保衛(wèi)細胞內(nèi)側(cè)壁外部閉合，呈現(xiàn)出內(nèi)陷的形態(tài)(圖5-D)。

由表2可知，薄殼山核桃受到干旱脅迫后總氣孔密度無顯著變化，但張開氣孔密度與關(guān)閉氣孔密度發(fā)生顯著變化，其中CK張開氣孔密度達到187 個·mm-2， MD閉合氣孔密度達到236 個·mm-2。由此可見，薄殼山核桃幼苗遭遇干旱脅迫時，葉片表皮的關(guān)閉氣孔密度顯著提高，以減少水分的散失，同時干旱脅迫也導(dǎo)致氣孔結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.7 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖6可知，CK的薄殼山核桃葉肉細胞結(jié)構(gòu)和葉綠體結(jié)構(gòu)均較完整，細胞呈條形，葉綠體緊貼壁分布，葉綠體基粒片層堆疊緊密，類囊體排列整齊。但MD的葉綠體與細胞壁脫離，細胞形狀變成卵圓形，葉綠體外被呈波浪狀，斷裂不完整，基粒和基質(zhì)類囊體模糊不可見，排列混亂，且在細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂質(zhì)。由此可見，在干旱脅迫下，薄殼山核桃幼苗葉肉細胞及葉綠體趨于損傷受脅迫狀態(tài)。

圖4 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片MDA含量和抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of drought stress on MDA content and protective enzyme activities in leaves of pecan seedlings

注：A：CK及MD葉片上表面；B：CK及MD葉片下表面；C：CK氣孔結(jié)構(gòu)；D：MD氣孔結(jié)構(gòu)。Note: A:Upper surface of blade of CK and MD. B:Lower surface of the blade of CK and MD. C:Stomatal structure of CK. D:Stomatal structure of MD.圖5 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉片氣孔結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of drought stress on stomatal structure of leaves of pecan seedlings

表2 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗氣孔數(shù)量的影響Table 2 Effect of drought stress on the number of stomata in pecan seedlings

注：A：CK細胞形態(tài)；B：MD細胞形態(tài)；C：CK葉綠體形態(tài)；D：MD葉綠體形態(tài)；Chl：葉綠體；CW：細胞壁；Gl：基粒片層；L：脂類。Note: A:Cell morphology of CK. B:Cell morphology of MD. C:Chloroplast morphology of CK. D:Chloroplast morphology of MD. Chl:Chloroplast. CW:Cell wall. Gl: Granum lamella. L:Lipid.圖6 干旱脅迫對薄殼山核桃幼苗葉肉細胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of drought stress on the ultrastructure of mesophyll cells in pecan seedlings

2.8 干旱脅迫下薄殼山核桃幼苗葉片各生理生化指標的相關(guān)性

由表3可知，Pn與Gs、Tr呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.923和0.933，但與SP含量、POD活性呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；SOD活性與葉綠素a、葉綠素b含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與Pro含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；MDA含量與SP含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；SP含量與CAT活性呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；葉綠素a含量與葉綠素b含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

2.9 薄殼山核桃幼苗葉片12個主要生理生化指標的主成分分析

根據(jù)特征值大于1的原則，通過主成分分析將干旱脅迫下12個生理生化指標轉(zhuǎn)換成4個主成分，可有效反映原12個指標90.150%的信息(表4)，理論上達到85%的累計貢獻率即可認為具有較強的信息代表性。根據(jù)各特征向量的絕對值大小，第1主成分在SP和MDA含量上均有較高的載荷量；第2主成分在Pn、Gs、Tr和POD含量上均有較高的載荷量；第3主成分在葉綠素a含量、葉綠素b含量、SOD活性和CAT活性上均有較高的載荷量；第4主成分在Ci和Pro含量上均有較高的載荷量?？梢姡ど胶颂业目购凳芏嘁蜃佑绊?，根據(jù)各指標在不同因子上的載荷，綜合相關(guān)分析確定，MDA含量、Pn、SOD活性、葉綠素b含量、Ci和Pro含量這6個生理指標為干旱反應(yīng)敏感的生理指標。

表3 干旱脅迫下薄殼山核桃幼苗葉片各生理生化指標的相關(guān)性Table 3 Correlation of physiological and biochemical indexes in leaves of pecan seedlings under drought stress

表4 薄殼山核桃幼苗葉片12個主要生理指標的主成分分析Table 4 Principal component analysis of twelve main physiological indexes of pecan seedlings

3 討論

干旱脅迫對植物造成最明顯的影響是抑制其生長[23]，表現(xiàn)為植株矮小、葉片加速衰老和脫落等現(xiàn)象[24]。本研究中，重度干旱脅迫下薄殼山核桃幼苗葉片枯萎，繼而停止生長甚至死亡。中度干旱脅迫下幼苗出現(xiàn)植株矮小與葉片脫落的現(xiàn)象，這與Diego等[25]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會抑制輻射松植物生長的結(jié)果相符合。本研究發(fā)現(xiàn)，與其他干旱處理相比，薄殼山核桃幼苗在輕度干旱脅迫下長勢最好，表現(xiàn)為株高最高和地徑最粗，說明適當?shù)母珊堤幚砟芷鸬健盁捗纭钡淖饔?，有利于幼苗的生長，這與劉世鵬等[24]發(fā)現(xiàn)適當脅迫有利于棗樹組培苗分蘗以及呂亮雪等[26]發(fā)現(xiàn)輕度土壤干旱處理有利于多年生落花生生長的研究結(jié)果相似，但具體作用機理有待進一步探究。

本試驗中，薄殼山核桃幼苗葉片Pn在干旱脅迫后大幅下降，同時葉綠素a和葉綠素b含量也隨著干旱脅迫時間的延長和干旱程度的增加呈下降趨勢，這與沙棘[27]、香樟[28]的研究結(jié)果一致，干旱脅迫引起幼苗光合速率下降的同時，光合電子傳遞受阻使過剩電子形成活性氧[29]，導(dǎo)致葉綠素含量的變化；另一方面，干旱脅迫引起葉片氣孔大量閉合，導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度的下降，這也是Pn下降的原因之一[30]，而Ci無顯著變化，此時可能非氣孔限制已成為光合速率降低的首要原因[31]。此外，干旱脅迫下葉綠體產(chǎn)生的活性氧會破壞葉綠體的膜結(jié)構(gòu)、基粒和基質(zhì)類囊體，并使其功能喪失[32]，導(dǎo)致幼苗Pn下降。而輕度脅迫下幼苗葉片葉綠素b含量最高，葉綠素的降解速度較緩慢，Pn較高，幼苗長勢較好，這與輕度脅迫的幼苗的生長狀態(tài)相適應(yīng)。

植物主要通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[33]和提高抗氧化酶活性[34]來應(yīng)對干旱脅迫不斷產(chǎn)生的ROS。榮少英等[35]對甜高粱幼苗的研究表明，Pro和SP是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究中，中度干旱脅迫下薄殼山核桃幼苗的Pro和SP含量迅速上升以應(yīng)對脅迫，干旱脅迫50 d時，SOD活性隨干旱程度的增加呈上升趨勢，因此SOD對薄殼山核桃抵御干旱脅迫有積極作用。中度干旱脅迫50 d時，幼苗的CAT活性低于對照，且POD活性較干旱脅迫20 d下降，說明干旱的強度及持續(xù)時間超出植物所能忍受的范圍會導(dǎo)致抗氧化酶活性下降[36]。

4 結(jié)論

薄殼山核桃幼苗會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、提高抗氧化酶活性和關(guān)閉氣孔等方式來應(yīng)對干旱氣候條件。薄殼山核桃幼苗在輕度干旱脅迫下長勢最好，中度干旱脅迫下葉片葉綠體結(jié)構(gòu)破損嚴重，重度干旱脅迫會導(dǎo)致幼苗死亡，故應(yīng)保證種植地土壤含水量處于田間持水量的50%～60%，若低于田間持水量的30%～40%應(yīng)及時補充水分以滿足幼苗的生長需要。結(jié)合對12個與抗旱相關(guān)的生理指標進行主成分分析，證明了葉片光合參數(shù)以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等生理指標與薄殼山核桃生理抗旱密切相關(guān)，可作為薄殼山核桃抗旱性鑒定提供理論依據(jù)。本研究為薄殼山核桃品種人工栽培及推廣應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。