電化學指紋圖譜技術(shù)鑒別黃酒品種和陳釀年份

張南南 吳小紅 王銘洲 曹 輝 夏 捷 金建忠

（浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院 杭州310015）

黃酒是我國的古老酒種，源于中國，與啤酒、葡萄油并稱為世界三大古酒。黃酒香氣濃郁，味美甘甜，風味醇厚，并含有氨基酸、糖、有機酸和多種維生素等營養(yǎng)成分。不同陳釀年份的黃酒品質(zhì)和價格差距較大。然而，黃酒生產(chǎn)和陳釀過程中無統(tǒng)一的評價和檢測標準，少數(shù)企業(yè)有隨意標注酒齡的行為[1]，如市售黃酒中存在以低酒齡黃酒冒充高酒齡黃酒的所謂“八年陳黃酒”、“十年陳黃酒”。鑒于此，建立一套快速、簡便、有效的評價系統(tǒng)，對黃酒品種和陳釀年份的鑒別有極其重要的作用。

指紋圖譜是經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn)代分析儀器測定得到的組分群體的特征圖譜或圖像。指紋圖譜能較充分地反映酒中所含化學成分的種類與數(shù)量，進而對其質(zhì)量進行整體描述和評價[2]。酒類指紋圖譜研究較多的是葡萄酒[3-6]和白酒[7-10]，對黃酒研究得較少[1，11]，大多采用氣相色譜法、高效液相色譜法及高級儀器聯(lián)用技術(shù)。現(xiàn)有方法均需對酒類樣品進行預處理，設(shè)備昂貴，操作復雜。電化學指紋圖譜具有樣品無需預處理，靈敏，操作簡單的特點，近年來廣泛應用于中草藥的鑒別[12-14]。

本試驗中采用H2SO4-（NH4）4Ce（SO4）4-CH2（COOH）2-KBrO3振蕩體系，系統(tǒng)考察振蕩體系各因素對黃酒電化學指紋圖譜的影響，在最佳測定條件下建立會稽山不同品種和陳釀年份黃酒的指紋圖譜，用于黃酒陳釀年份和品種的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純和十二年紹興花雕酒、純和八年紹興花雕酒、古釀六年紹興花雕酒、古釀三年紹興花雕酒、純正五年紹興酒、醇香三年黃酒、宋法原造三年陳紹興花雕酒，產(chǎn)自會稽山紹興酒股份有限公司。

硫酸、溴酸鉀、丙二酸、硫酸鈰銨均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI620E 型電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；RTC 基本型磁力攪拌器+ETS D5，德國IKA；217 型飽和甘汞電極、213 型鉑電極，天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 電化學指紋圖譜測定 量取一定量的黃酒加入反應器中，在保持反應總體積100 mL 的前提下依次加入一定量的硫酸、硫酸鈰銨和丙二酸溶液，在設(shè)定溫度和攪拌速度下恒溫攪拌10 min后加入一定量溴酸鉀，繼續(xù)恒溫攪拌。以217 飽和甘汞電極作參比，213 型鉑電極作指示電極，以溴酸鉀加入時計時，記錄電化學振蕩體系中電位（E）隨時間（t）的變化，獲取黃酒電化學指紋圖譜特征參數(shù)，繪制E-t 曲線。

1.3.2 系統(tǒng)相似度計算方法 參照方宣啟等[15]報道的系統(tǒng)相似度計算方法，以各種黃酒電化學指紋圖譜平均參數(shù)為參照，計算黃酒指紋圖譜系統(tǒng)相似度，計算公式如下：

式中：Q積——系統(tǒng)相似度；n——參數(shù)的個數(shù)；ai，bi——每個圖譜第i 個參數(shù)的平均值或?qū)牡趇 個參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒電化學指紋圖譜測定條件

選取會稽山醇香三年黃酒與純正五年紹興酒做對比試驗，以誘導時間、最大振幅、振蕩壽命、最高電位和最低電位5 個電化學指紋圖譜特征參數(shù)的差值最大化為目標，做單因素試驗，研究溫度、轉(zhuǎn)速、硫酸鈰銨濃度、氫離子濃度、丙二酸濃度、溴酸鉀及黃酒用量等因素對黃酒電化學指紋圖譜的影響，確定最佳的電化學指紋圖譜測定條件。

2.1.1 溫度對黃酒電化學指紋圖譜的影響 在其它條件（6.00 mL 黃酒，轉(zhuǎn)速850 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別在34，35，36，37，38，39，40℃測定所選2 種黃酒的電化學指紋圖譜，研究溫度對黃酒電化學指紋圖譜的影響，結(jié)果見圖1和表1。試驗表明：溫度太低振蕩不明顯，34℃時會稽山純正五年紹興酒幾乎無振蕩產(chǎn)生，故舍去；39℃時誘導時間差、最低電位差、振蕩壽命差以及最大振幅差均為最大值，因此選取39℃為最適溫度。

圖1 不同溫度下黃酒的電化學指紋圖譜Fig.1 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different temperatures

表1 不同溫度下會稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 1 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different temperatures

2.1.2 黃酒加入量對黃酒電化學指紋圖譜的影響在其它條件（溫度39℃，轉(zhuǎn)速850 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116g） 不變的情況下，分別加入8.00，4.00，2.00，1.60，1.40，1.20 mL黃酒做試驗，黃酒加入量對黃酒電化學指紋圖譜的影響見圖2和表2。加入黃酒8.00 mL 時幾乎看不到振蕩曲線，隨著黃酒量的減少，振蕩壽命和振蕩幅度增加，當黃酒加入量為1.40 mL 時圖譜差距最大。最終選擇1.40 mL 為黃酒最佳加入量。

2.1.3 轉(zhuǎn)速對黃酒電化學指紋圖譜的影響 在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別在850，800，750，700，650，600 r/min 轉(zhuǎn)速下做試驗，考察攪拌速度對黃酒電化學指紋圖譜的影響，結(jié)果見圖3和表3。當轉(zhuǎn)速為650 r/min 時兩種黃酒的圖譜參數(shù)相差最大。最終選擇650 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。

圖2 不同黃酒加入量的電化學指紋圖譜Fig.2 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different dosages

表2 不同黃酒加入量的會稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 2 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different Chinese rice wine dosages

圖3 不同轉(zhuǎn)速下黃酒的電化學指紋圖譜Fig.3 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different stirring rates

表3 不同轉(zhuǎn)速下會稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 3 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different stirring rates

2.1.4 溴酸鉀濃度對黃酒電化學指紋圖譜的影響在其它條件（1.40 mL 黃酒，溫度39℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L） 不變的情況下，分別加入溴酸鉀0.8484 g （0.05080 mol/L）、0.9280 g（0.05880 mol/L）、1.116 g （0.06680 mol/L）、1.249 g（0.07480 mol/L）做試驗，考察溴酸鉀濃度對黃酒電化學指紋圖譜的影響（圖4和表4）。隨著溴酸鉀濃度增大，振蕩曲線的振蕩壽命延長，當溴酸鉀用量1.116 g，溶液中濃度為0.06680 mol/L 時，兩張圖譜的參數(shù)差值最大，最終選擇溴酸鉀1.116 g 為最佳條件。

圖4 同溴酸鉀濃度下黃酒的電化學指紋圖譜Fig.4 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different KBrO3 concentrations

表4 不同溴酸鉀濃度下會稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 4 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different KBrO3 concentrationas

2.1.5 硫酸鈰銨濃度對黃酒電化學指紋圖譜的影響 在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別加入0.1000 mol/L 硫酸鈰銨溶液4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 mL，其濃度分別為0.004000，0.005000，0.006000，0.007000，0.008000 mol/L，考察硫酸鈰銨濃度對黃酒電化學指紋圖譜的影響（圖5和表5）。當溶液中硫酸鈰銨濃度為0.006000 mol/L 時，圖譜參數(shù)相差最大，為試驗最佳條件。

圖5 不同硫酸鈰銨濃度下黃酒的電化學指紋圖譜Fig.5 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different （NH4）4Ce（SO4）4 concentrations

表5 不同硫酸鈰銨濃度下會稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 5 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different （NH4）4Ce（SO4）4 concentrations

2.1.6 氫離子濃度對黃酒電化學指紋圖譜的影響在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g），分別在氫離子濃度 為2.000，1.800，1.600，1.400、1.200 mol/L 的條件下試驗，考察氫離子濃度對黃酒電化學指紋圖譜的影響（圖6和表6）。當溶液中氫離子濃度為1.800 mol/L 時圖譜參數(shù)相差最大，為試驗最佳條件。

圖6 不同氫離子濃度下黃酒的電化學指紋圖譜Fig.6 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different hydrogen ion concentrations

表6 不同氫離子濃度下會稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 6 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different hydrogen ion concentrations

2.1.7 丙二酸濃度對黃酒電化學指紋圖譜的影響在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，氫離子濃度1.800 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別加 入1.000 mol/L 丙 二 酸10.00，8.00，6.00，4.00 mL（濃度分別為0.1000，0.08000，0.06000，0.04000 mol/L）做試驗，其黃酒電化學指紋圖譜見圖7和表7。當丙二酸加入量為4.00 mL 時因丙二酸不足而導致振蕩效果不佳；當丙二酸加入量為6.00 mL 時振蕩時間過長，醇香三年甚至超過1 h；當丙二酸加入量為8.00 mL 比加入量10.00 mL 時參數(shù)相差大，最終選擇8.00 mL（0.08000 mol/L）為最佳條件。

圖7 不同丙二酸濃度下黃酒的電化學指紋圖譜Fig.7 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different CH2（COOH）2 concentrations

表7 不同丙二酸濃度下會稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 7 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different CH2（COOH）2 concentrations

2.2 黃酒電化學指紋譜庫建立及相似度判斷

在上述試驗確定的最佳黃酒電化學指紋圖譜測定條件下，對7 種會稽山公司生產(chǎn)的不同品種和陳釀年份黃酒進行測定。分別平行測定3 份，建立其電化學指紋譜庫（圖8和表8），并以各種黃酒電化學指紋圖譜平均參數(shù)為參照，計算黃酒電化學指紋圖譜系統(tǒng)相似度（結(jié)果見表9）。

結(jié)果顯示：同種黃酒電化學指紋圖譜的系統(tǒng)相似度在98.03%～99.57%范圍，不同種黃酒的系統(tǒng)相似度在83.36%～97.14%范圍。以臨界系統(tǒng)相似度Qc=（97.14%+98.03%）/2=97.59%作為鑒別品種的判據(jù)，即電化學指紋圖譜系統(tǒng)相似度＞97.59%時屬同種黃酒，當相似度≤97.59%時為非同種黃酒。

表8 會稽山黃酒電化學指紋圖譜參數(shù)Table 8 The charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan Chinese rice wine

（續(xù)表8）

表9 以各種黃酒電化學指紋圖譜參數(shù)為參照計算的黃酒指紋圖譜系統(tǒng)相似度Table 9 The system similarities of electrochemical fingerprints of Chinese rice wine based on electrochemical fingerprint parameters of all kinds of Chinese rice wine

圖8 黃酒電化學指紋圖譜Fig.8 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine

3 結(jié)論

選 用H2SO4-（NH4）4Ce（SO4）4-CH2（COOH）2-KBrO3為振蕩體系，確定黃酒電化學指紋圖譜最佳的測定條件為：溶液總體積100 mL，溫度39℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，硫酸鈰銨濃度0.006000 mol/L，氫離子濃度1.800 mol/L，丙二酸濃度0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g，黃酒1.40 mL。不同品種和陳釀年份黃酒的電化學指紋圖譜主要特征參數(shù)存在著顯著差異，并有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。采用電化學指紋圖譜系統(tǒng)相似度可識別黃酒的品種和陳釀年份，當電化學指紋圖譜系統(tǒng)相似度＞97.59%時屬同種黃酒，當相似度≤97.59%時為非同種黃酒。本研究為不同黃酒品種和陳釀年份的鑒別提供了一種簡便方法。