乳酸菌粘附腸道上皮細(xì)胞的研究進(jìn)展

占 萌 李 春 李慧臻 李 娜 焦文姝 王成風(fēng) 霍貴成 李柏良

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150030）

在人類和其它哺乳動物的胃腸道中大約居住著1014細(xì)菌，共1 000 多種，它們在生長和形成不同微生物菌群的過程中會不斷與宿主相互作用。這些細(xì)菌產(chǎn)生大量的代謝物被宿主視為刺激因子。微生物菌群的行為顯著影響宿主的健康。近年來，使用全基因組分析技術(shù)對細(xì)菌進(jìn)行全基因組測序和微生物群的宏基因組分析，揭示了宿主與人體復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌共生關(guān)系的結(jié)構(gòu)。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB） 是人體腸道中的優(yōu)勢菌群，尤其在十二指腸到回腸末端的區(qū)域含量豐富。乳酸菌是可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱。研究表明LAB 具有促進(jìn)營養(yǎng)成分的分解、吸收，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，治療腹瀉[1]，改善胃腸道功能和降低膽固醇及抗氧化[2-3]等作用。胃腸道中定殖的乳酸菌數(shù)量和種類與機(jī)體的健康功能密切相關(guān)。乳酸菌對胃腸道的粘附是其定植的關(guān)鍵先決條件之一，也是發(fā)揮益生功能的首要條件。

粘附是長期歷史進(jìn)化過程中產(chǎn)生的生態(tài)特性，其特點(diǎn)是特異性和生理性。產(chǎn)生這種特性的根本原因是“生命與環(huán)境的同一性”。粘附（adhesion）通常指微生物與宿主的上皮細(xì)胞接觸后，通過生物化學(xué)作用使微生物與宿主細(xì)胞上皮表面相連接。乳酸菌對腸道上皮細(xì)胞的特異性粘附作用有助于其在腸道定植，增強(qiáng)乳酸菌與腸道細(xì)胞之間的信號交流，抑制病原菌在腸道的定植和提高機(jī)體的免疫力。乳酸菌在腸道中定植的前提是其必須粘附于宿主細(xì)胞表面[4-5]。目前普遍將乳酸菌粘附性作為評價(jià)其能否成為益生菌的首要標(biāo)準(zhǔn)[6-8]。

1 乳酸菌粘附的生物學(xué)效應(yīng)

1.1 維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)

乳酸菌粘附于腸道黏膜有助于維持腸黏膜形態(tài)與功能的完整性，對保證腸道正常菌群穩(wěn)態(tài)具有重要作用。乳酸菌主要通過空間位阻效應(yīng)來維護(hù)腸道菌群的正常結(jié)構(gòu)[9]。病原菌使宿主致病的第1 步是對腸道上皮細(xì)胞的粘附。當(dāng)高黏附性的LAB 先于病原菌定植在腸道時(shí)，占據(jù)了致病菌的粘附位點(diǎn)，阻斷其與腸黏膜的接觸，在腸道表面形成一層物理屏障，從而抑制定植和轉(zhuǎn)位，維護(hù)腸黏膜的完整性和腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境[10]。Singh 等[11]研究表明受試的8 株活羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）均能抑制大腸桿菌ATCC25922 （Escherichia coli ATCC25922）、傷寒桿菌NCDC113（Salmonella typhi NCDC113）、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌ATCC53135（Listeria monocytogenes ATCC53135）和糞腸球菌NCDC115 （Enterococcus faecalis NCDC115）對Caco-2 細(xì)胞的粘附作用。

1.2 調(diào)控黏蛋白表達(dá)

覆蓋在胃腸道表面的黏液層是微生物菌群與宿主之間的第1 個(gè)接觸點(diǎn)，它為微生物群提供了棲息地。黏液由腸道表面內(nèi)的杯狀細(xì)胞（goblet cell）分泌，黏蛋白（mucins）是其主要組分[12]。目前比較完整的乳酸菌遺傳學(xué)工具和分析技術(shù)的進(jìn)步顯著加快了對乳酸菌菌株識別和粘附黏蛋白的分子機(jī)制研究。這些機(jī)制涉及細(xì)菌表面相關(guān)的多種粘附素與黏蛋白鏈，即碳水化合物-蛋白質(zhì)的相互作用。Hymes 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，相對于親本菌株，敲除纖連結(jié)合蛋白基因（fbpB）的突變菌株嗜酸乳桿菌NCFM （L.acidophilus NCFM）（ΔfbpB mutant）在體外對黏蛋白的黏附性發(fā)生顯著降低。ΔfbpB突變體對人血漿纖連蛋白的黏附性降低了72%，對豬胃III 型黏蛋白的黏附性降低了47%。表明NCFM 菌體表面的纖連結(jié)合蛋白具有與黏蛋白結(jié)合的能力。LAB 與黏蛋白的相互作用，不僅有利于自身的長期穩(wěn)定定植，而且能夠調(diào)控黏蛋白的表達(dá)與分泌，增加黏液層厚度，增強(qiáng)黏膜免疫力，進(jìn)而穩(wěn)固黏膜屏障。李晶[15]通過體外黏蛋白模型從哺乳仔兔小腸黏膜中分離到的菌株中篩選出高粘附菌株植物乳桿菌2（L．plantarum 2），并且發(fā)現(xiàn)單獨(dú)灌服植物乳桿菌2 仔兔小腸中有益菌比例增加，回腸絨毛生長旺盛和空腸、回腸黏蛋白MUC1，MUC2 的mRNA 表達(dá)水平提高，黏膜屏障功能增強(qiáng)。

1.3 增強(qiáng)細(xì)胞間的信號交流

當(dāng)LAB 的粘附素與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合時(shí)，就會啟動一系列信號傳遞過程。Konstantinov 等[16]研究了嗜酸乳桿菌NCFM 及其細(xì)胞表面化合物與樹突狀細(xì)胞 （dendritic cells，DCs）之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)NCFM 通過與樹突狀細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞間粘附分子C 型凝結(jié)素（DC-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin，DCSIGN）結(jié)合，誘導(dǎo)IL-10 和IL-12p7 濃度依賴性產(chǎn)生。益生乳酸菌代謝物也能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號途徑來保護(hù)腸道屏障。由鼠李糖乳桿菌GG（L.rhamnosus GG，LGG）分泌的p40 和p70 蛋白可阻止細(xì)胞素引起的細(xì)胞調(diào)亡，進(jìn)而增強(qiáng)腸屏障功能，主要有兩種途徑可能通過磷酸肌醇-3’-激酶（PI3K）的依賴性途徑激活抗細(xì)胞調(diào)亡蛋白激酶B（Akt/PKB）或通過抑制TNF-α，IFN-γ 或IL-1β 對促凋亡p38 絲裂原活化蛋白激酶 （p38/MAPK）活化[17-18]。

1.4 粘附的特異性

乳酸菌的粘附具有菌株特異性和宿主特異性。不同菌種對同種宿主的粘附能力也存在差異，即使菌種相同，由于在菌株水平上存在差異，其黏附性也不盡相同。Tuo 等[8]檢測了15 株植物乳桿菌、5 株干酪乳桿菌和2 株鼠李糖乳桿菌對Caco-2 細(xì)胞的粘附能力，發(fā)現(xiàn)同種乳酸菌的不同菌株的粘附能力差異較大。Argyri 等[19]從食品中分離出37 株戊糖乳桿菌，同樣發(fā)現(xiàn)不同菌株的粘附能力差異較大，粘附能力最高達(dá)60.78%，最低僅33.72%。同樣，對于同一乳酸菌菌株，粘附不同的宿主，最后的結(jié)果也可能不同，表現(xiàn)出明顯的宿主特異性。分離自同一群體的乳酸菌對本群體腸道的粘附能力較本群外的動物更強(qiáng)，甚至不在本群外的動物腸道中粘附[20]。

2 粘附機(jī)制

20世紀(jì)90年代初，1 株乳桿菌菌株用蛋白酶處理后，對HT29-MTX 細(xì)胞分泌的黏液的黏附量減少[21]。第1 次研究表明了乳桿菌中存在與病原菌相似的粘附過程，即：菌體細(xì)胞表面的某個(gè)成分與腸上皮細(xì)胞受體的相互作用。近些年來，關(guān)于乳酸菌粘附特性的研究十分廣泛，包括從分子水平和基因水平探索乳酸菌與腸道上皮細(xì)胞或者胞外基質(zhì)的粘附機(jī)制。目前普遍認(rèn)為LAB 的粘附是乳酸菌表面特異性識別分子和宿主靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體，在空間結(jié)構(gòu)上相互匹配并結(jié)合，也就是黏附素－受體學(xué)說。

2.1 黏附素

黏附素分為蛋白類黏附素和非蛋白類黏附素。蛋白類黏附素又包括表層蛋白 （S-層蛋白，SLP）和轉(zhuǎn)肽酶依賴蛋白（包括黏液結(jié)合蛋白和菌毛蛋白）[21-22]。這些蛋白黏附素也是目前研究較深入和廣泛的黏附素。表1中列出目前報(bào)道的乳酸菌的黏附素。

2.1.1 表層蛋白 乳酸菌表層蛋白是目前研究最多，也是乳酸菌中比較普遍的一類黏附素。S-層蛋白幾乎存在于所有的革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌中，由單分子晶體排列的單一蛋白質(zhì)亞單位或糖蛋白以對稱的排列形式構(gòu)成，通過非共價(jià)鍵連接于多數(shù)細(xì)菌的細(xì)胞壁[23]。乳桿菌的表層蛋白是已知的表層蛋白中相對分子質(zhì)量最小的一類，介于25～71 ku 之間，占細(xì)胞蛋白總量的10%～15%，具有高度穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)[15]。與其它菌種相比，乳桿菌的SLP 等電點(diǎn)范圍在9.35～10.40 之間。多數(shù)菌種SLP 的等電點(diǎn)較低，而乳桿菌SLP 等電點(diǎn)偏高成為其獨(dú)有的特征之一[24]。目前已從多種乳酸菌中分離鑒定出表層蛋白。如嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌（L.helveticus）、短乳桿菌（L.brevis）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）、開菲爾乳桿菌（L.kefir）、布氏乳桿菌 （L.buchneri）、類高加索酸奶乳桿菌（L.parakefir）和格氏乳桿菌（L.gasseri）等，大部分乳酸菌的SLP 為非糖基化結(jié)構(gòu)，也有少數(shù)乳酸菌（如布氏乳桿菌和開菲爾乳桿菌）具有糖基化的SLP，并且大部分乳酸菌都有編碼SLP 的基因[15]。其中，嗜酸乳桿菌ATCC 4356 和NCFM、卷曲乳桿菌JCM 5810 均含有兩個(gè)SLP 編碼基因，短乳桿菌ATCC 14869 和嗜酸乳桿菌KLDS1.0901 各含有3個(gè)編碼SLP 的基因。具有親緣性的菌株的SLP 編碼基因序列具有相似性[25]。

表1 乳酸菌相關(guān)的黏附素Table 1 Adhesion factors in Lactobacillus species

關(guān)于SLP 結(jié)合到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白并粘附到腸上皮細(xì)胞的證據(jù)己從嗜酸乳桿菌NCFM 的SlpA 蛋白[26]、卷曲乳桿菌JCM5810 的CbsA 蛋白[27]、卷曲乳桿菌ZJ001 中的SlpB 蛋白[28]和短乳桿菌ATCC8187 的SlpA[29]蛋白中得到證實(shí)。對于SLP 具體哪一段氨基酸序列參與ECM 組分的粘附，有研究表明卷曲乳桿菌JCM5810 CbsA 蛋白N 端位置31～274 處的氨基酸殘基是與雞結(jié)腸膠原蛋白結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域[30]。短乳桿菌ATCC 8287 的S-層蛋白SlpA 介導(dǎo)了菌體細(xì)胞與人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系和纖連蛋白的結(jié)合，并且SlpA N 末端的81 個(gè)氨基酸足以與上皮細(xì)胞結(jié)合[31]。

近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，表層蛋白對乳酸菌發(fā)揮益生功能有著卓著的貢獻(xiàn)。SLP 除了作為黏附因子介導(dǎo)乳酸菌粘附定殖于腸道上細(xì)胞或ECM 蛋白以延長其在腸道中發(fā)揮益生作用的時(shí)間之外，還有助于乳桿菌抑制病原菌對腸道組織的感染，減少致病菌對腸道的細(xì)胞傷害，以及調(diào)節(jié)免疫的功能[26]。有研究報(bào)道嗜酸乳桿菌ATCC 4356 的SLP 可以結(jié)合特異性抗原DC-SIGN，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制胡寧病毒引起的細(xì)胞損傷[32]。

2.1.2 黏液結(jié)合蛋白 在目前發(fā)現(xiàn)的乳酸菌黏蛋白粘附因子中，黏液結(jié)合蛋白家族可能是研究最廣泛的。最初在羅伊氏乳桿菌1063 和嗜酸乳桿菌NCFM 中發(fā)現(xiàn)，MUB 蛋白是一種大分子蛋白質(zhì)（分子質(zhì)量≥300 ku），其N-端具有一個(gè)特征性YSIRK 分泌信號序列，以及C-末端存在一個(gè)轉(zhuǎn)肽酶依賴性LPXTG 錨定基序[33-34]。MUB 蛋白包含兩個(gè)特征保守的重復(fù)區(qū)域 （如圖2所示），分別為Mub1 和Mub2，每個(gè)重復(fù)序列由183～206 個(gè)氨基酸殘基組成。Mackenzie 等[35]通過使用MUB 蛋白抗體的抑制試驗(yàn)證實(shí)MUB 蛋白在羅伊氏乳桿菌ATCC 53068 中作為黏蛋白粘附因子的作用。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)MUB 的重復(fù)序列與單核增生李斯特菌報(bào)道的黏液蛋白結(jié)合蛋白 （MucBP，PF06458）域和氨基酸序列高度相似[36]，這促使對其它菌種中MucBP 同源蛋白的進(jìn)一步研究。目前為止已在很多乳酸菌中發(fā)現(xiàn)和MucBP 結(jié)構(gòu)域相似的氨基酸序列的表面蛋白，然而很少對它們的真正作用做深入研究。最近從羅伊氏乳桿菌中提取純化的MUB 蛋白的組織學(xué)分析表明，MUB 蛋白能識別黏蛋白鏈末端的唾液酸殘基，因此MUB 蛋白粘附于黏蛋白的具體作用方式正在逐漸被發(fā)現(xiàn)[37]。此外，基于MucBP 相關(guān)結(jié)構(gòu)域 （MUBAD） 化學(xué)合成的MUB70，不同于羅伊氏乳桿菌mub 編碼的MucBP結(jié)構(gòu)域，其特征是能與Muc2 型黏蛋白的硫酸碳水化合物結(jié)合。而在結(jié)腸黏液癌發(fā)病過程中，Muc2 型黏蛋白分泌過多，因此基于MUB70的特異性結(jié)合親和力可以開發(fā)出黏膜癌的潛在標(biāo)記物。隨著生物信息分析技術(shù)的發(fā)展，通過菌體基因組分析序列中存在的YSIRK 信號、LPXTG 序列或MucBP 結(jié)構(gòu)域推定假定的黏附因子。比如，鼠李糖乳桿菌中發(fā)現(xiàn)的黏膜結(jié)合因子（MBF）能與層黏連蛋白、纖連蛋白、IV 型膠原等黏蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白結(jié)合[38]。

圖1 MUB 蛋白和SpaCBA 菌毛蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[43]Fig.1 Schematic model of MUB and SpaCBA pili[43]

2.1.3 菌毛蛋白 菌毛（fimbriae）長期以來被認(rèn)為是致病菌特有的特征。然而，對約氏乳桿菌NCC533 進(jìn)行全基因組測序后，在乳桿菌屬物種中首次發(fā)現(xiàn)編碼菌毛的基因簇[39]。隨后，通過免疫電鏡在鼠李糖乳桿菌GG 細(xì)胞表面鑒定出菌毛。鼠李糖乳桿菌菌毛是由3 個(gè)亞基SpaA，SpaB 和SpaC（稱為SpaCBA）聚合形成[40]（如圖2所示）。其中SpaC 分布于菌毛整個(gè)長度，具有凝集素樣特征，能夠特異性結(jié)合位于黏蛋白非還原末端的半乳糖基[41]。除了SpaCBA 操縱子外，在鼠李糖乳桿菌GG 基因組中還發(fā)現(xiàn)第2 類菌毛基因 （稱為SpaFED）[40]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） 中也存在SpaFED 菌毛蛋白，位于頂端的SpaF 菌毛蛋白是介導(dǎo)菌體細(xì)胞與黏蛋白、膠原蛋白和纖連蛋白以及Caco-2 和HT-29 腸細(xì)胞系相互作用的重要決定因素[42]。

2.1.4 其它黏附素 乳酸菌粘附到胃腸道的過程中除這些常見的蛋白因子參與外，還有一些兼職蛋白，除了行使主要功能外，也參與乳酸菌的粘附作用。如EF-Tu，GAPDH，伴侶蛋白GroEL，ATP 結(jié)合體（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)子等[43]。這些蛋白不含有典型的保守細(xì)胞表面錨定基序，其在細(xì)胞表面的定位受環(huán)境因素的影響，這些蛋白質(zhì)可作為次要的黏附因子發(fā)揮作用，然而它們與碳水化合物鏈表現(xiàn)出特定的相互作用。最近研究[44]發(fā)現(xiàn)乳桿菌表面的丙酮酸激酶（PK），葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（PGI）、磷酸甘油酸激酶（PGK）、伴侶蛋白GroEL 和EF-Tu能與宿主表面的肌動蛋白粘附。此外，PGK-肌動蛋白結(jié)合域分析顯示，PGK 中127 號氨基酸位置的賴氨酸可能在介導(dǎo)細(xì)菌粘附肌動蛋白的過程中起關(guān)鍵作用。

一些非蛋白因子在乳酸菌粘附宿主的過程中也發(fā)揮著重要作用。早在1985年，Camp 等[44]在研究雙歧桿菌的粘附時(shí)發(fā)現(xiàn)，LTA 通過增加細(xì)胞壁的電負(fù)性及疏水性影響乳桿菌粘附腸上皮細(xì)胞的能力。目前已發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌細(xì)胞表面的EPS、脂多糖（LPS）以及肽聚糖（WPG）等成分在乳酸菌的粘附過程中也起到一定的作用[45-46]。研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌中不同類型的EPS 影響細(xì)菌粘附到ECM組分的過程[47]。在嗜酸乳桿菌BG2F04 中，細(xì)菌表面的碳水化合物部分介導(dǎo)了菌株粘附到Caco-2細(xì)胞及由HT-29-MTX 分泌的黏液層的過程[48]。

2.2 黏附受體

黏附素受體是乳酸菌與宿主細(xì)胞粘附的關(guān)鍵成分之一。乳酸菌表面含有一些黏附素，只有宿主細(xì)胞有針對這些黏附素的特異性受體才能完成粘附過程，進(jìn)而傳遞胞外信號，啟動一系列細(xì)胞生物化學(xué)反應(yīng)。菌株的黏附素受體種類顯著影響粘附方式，也可以認(rèn)為黏附過程具有菌株特異性。值得注意的是黏附受體的成分會隨著生物體的發(fā)育分化和營養(yǎng)物質(zhì)的變化而改變，相應(yīng)的配體也會隨之變化，這就解釋了為什么幼小畜禽和嬰兒在不同的生命階段腸道菌群有演替變化的過程。例如：嬰兒在剛出生時(shí)腸道菌群以大腸桿菌和鏈球菌為主。在母乳喂養(yǎng)期，腸道中雙歧桿菌數(shù)量急劇增加，同時(shí)大腸桿菌和鏈球菌減少。斷奶后，鏈球菌和大腸桿菌的數(shù)量進(jìn)一步減少，出生后的第2年會形成成人型的腸道菌群[49]。

目前鮮有研究報(bào)道乳酸菌的黏附素受體。張博[47]將HT-29 細(xì)胞用高碘酸鈉處理后，與乳酸乳球菌NZ900 共孵育，做黏附試驗(yàn)，結(jié)果表明：NZ900 對處理的細(xì)胞黏附量與處理前無差異，推測糖類不是菌體表面CwaA 蛋白的主要黏附受體。通過糖抑制試驗(yàn)證實(shí)CwaA 蛋白的黏附受體中不含有C－C 單鍵，即不是糖或糖蛋白。再通過蛋白酶處理試驗(yàn)表明CwaA 的黏附受體可能是蛋白類物質(zhì)，因此隨蛋白酶的處理濃度的提高，對HT-29 細(xì)胞的粘附能力逐漸下降。Fujiwara 等[50]研究發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）培養(yǎng)液中存在的一些分泌蛋白可以抑制產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌（ETEC）的特異性受體GA1 的粘附，抑制效果隨著加入分泌蛋白濃度的增加而增強(qiáng)，表明腸道上皮細(xì)胞表面的GA1 位點(diǎn)也有可能是長雙歧桿菌黏附素的受體。長雙歧桿菌通過競爭性地與GA1 位點(diǎn)結(jié)合，有效排斥病原菌與腸上皮細(xì)胞的粘附。對羅伊氏乳桿菌的研究表明，該菌株能夠特異性地與腸上皮細(xì)胞外側(cè)的糖脂和硫苷脂結(jié)合，這兩種成分可能是羅伊氏乳桿菌黏附素受體[51]。目前對乳酸菌黏附素受體的報(bào)道很少，大部分研究多是推測黏附素受體可能的類型與性質(zhì)，很少在分子水平對黏附素受體進(jìn)行鑒定，以及分析其與黏附素的作用機(jī)制。關(guān)于乳酸菌黏附素特異性受體的鑒定及相互作用需更深入研究和發(fā)掘。

3 影響乳酸菌粘附的因素

乳酸菌的粘附效應(yīng)不僅與黏附素和黏附受體的特征相關(guān)，也與外界的環(huán)境，如溫度、酸堿度、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)，以及菌體生長階段、菌液濃度、菌體表面理化性等自身因素也影響乳酸菌的黏附性。

有研究報(bào)道，溫度對植物乳桿菌的黏附性是破壞性的，因?yàn)闇囟瓤赡軙淖內(nèi)樗峋砻骛じ剿氐慕Y(jié)構(gòu)，從而影響菌體與腸道上皮細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合，使乳酸菌的黏附能力下降。也有研究表明，溫度對雙歧桿菌的黏附性沒有顯著影響，即使雙歧桿菌在較高的溫度下預(yù)處理一段時(shí)間，其粘附能力與活菌非常相似[52]。可能溫度對黏附性的影響存在菌株差異性。Yadav 等[53]研究了pH 值對植物乳桿菌Lp5276，Lp91 與膠原蛋白相互作用的影響，結(jié)果表明在pH 6 時(shí)，兩株植物乳桿菌對膠原蛋白的粘附性較高。

pH 值對乳酸菌粘附能力的影響具有菌株差異性?？傮w而言，在偏酸性或中性條件下有利于乳酸菌的粘附。離子濃度也顯著影響乳酸菌的黏附性，尤其是Ca2+。王斌等[54]研究了Ca2+濃度對植物乳桿菌L2 粘附Caco-2 和IEC-6 細(xì)胞能力的影響，結(jié)果表明，L2 對兩種細(xì)胞的黏附量分別達(dá)到595 CFU/100 細(xì)胞和538 CFU/100 細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)液中增加濃度為0.9 mol/L Ca2+時(shí)，L2 菌粘附IEC-6 細(xì)胞的數(shù)量高達(dá)11 700 CFU/100 細(xì)胞，表明Ca2+能顯著增強(qiáng)L2 菌的粘附能力。Ca2+促進(jìn)粘附效果可能是因?yàn)榧せ盍薈a2+介導(dǎo)的信號通路，從而促進(jìn)細(xì)菌與細(xì)胞表面受體間的特異性結(jié)合。

乳酸菌在不同的生長階段，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌體活性、代謝產(chǎn)物等都有一定的差異。大量研究表明，大多數(shù)乳酸菌生長到穩(wěn)定期初期的黏附性大于其它時(shí)期?？赡茉诜€(wěn)定期初期，菌體細(xì)胞形態(tài)趨于完整，且表達(dá)較高的黏附素。一般情況下，隨著菌懸液濃度的增大，乳酸菌黏附能力也隨之增大，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，乳酸菌黏附量趨于穩(wěn)定。研究報(bào)道[55]當(dāng)植物乳桿菌菌體濃度在2×108CFU/mL 以上時(shí)，其對Caco-2 細(xì)胞黏附性沒有顯著差異，說明菌體達(dá)到飽和占位狀態(tài)。乳酸菌的表面疏水性也對其黏附能力產(chǎn)生一定影響。最近幾年將其作為評價(jià)乳酸菌黏附性的重要指標(biāo)。乳酸菌表面疏水性是由其表面疏水性的蛋白質(zhì)、糖類及其它化合物所賦與的一種表面特性。Ehrmann 等[56]研究表明，乳桿菌的疏水性與其黏附能力高度相關(guān)，疏水性越高的細(xì)菌其黏附力越強(qiáng)，反之，細(xì)菌的黏附力較低。

4 乳酸菌黏附的評價(jià)方法

目前已建立多種檢測方法來評價(jià)乳酸菌的黏附性能，主要分為直接測定法和間接測定法。直接測定法一般采用體外細(xì)胞模型模擬人體腸道上皮細(xì)胞，通常用Caco-2、HT-29 和Hela 細(xì)胞等模型與乳酸菌共同孵育一段時(shí)間后，通過粘附計(jì)數(shù)來評價(jià)乳酸菌的粘附效果。通過革蘭氏染色后顯微鏡觀察和平板計(jì)數(shù)的方法檢測黏附量。這些方法存在一定缺陷，主要是與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果存在差異，忽略了人體腸道上皮細(xì)胞表面覆蓋著一層厚厚的黏液層，通常情況下乳酸菌無法通過黏液層直接接觸上皮細(xì)胞。乳酸菌若要與上皮細(xì)胞發(fā)生作用引起特異應(yīng)答，首先要粘附于黏液層。也有學(xué)者直接采用黏蛋白模型來評價(jià)乳酸菌的粘附能力。Buntin 等[57]利用體外黏蛋白模型評價(jià)了18 株植物乳桿菌的粘附特性。

還有研究報(bào)道用熒光染料標(biāo)記乳酸菌，對菌體進(jìn)行追蹤指示，進(jìn)而觀察乳酸菌對腸黏膜的粘附能力。細(xì)胞增殖示蹤熒光探針（cFDA-SE）和異硫氯酸標(biāo)記（FITC）是兩種比較常用的標(biāo)記染料。其中cFDA-SE 對乳酸菌進(jìn)行標(biāo)記具有安全性高、方法很簡單、省時(shí)、標(biāo)記率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，對最終收集到的乳酸菌用流式細(xì)胞儀等儀器檢測標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量，便可計(jì)算乳酸菌的黏附率。謝瓊[55]用cFDA-SE 標(biāo)記植物乳桿菌ZDY2013 后，灌胃給小鼠，探究植物乳桿菌ZDY2013 在體內(nèi)的粘附情況是否與體外試驗(yàn)一致。流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記的乳酸菌在小鼠腸道中的定植結(jié)果表明，ZDY2013能很好地附在小鼠的不同腸段，與體外試驗(yàn)結(jié)果有較好的一致性。目前也有一些研究者基于酶聯(lián)免疫（ELISA）的方法檢測乳酸菌的粘附性能[58]。雖然ELISA 的方法可以同時(shí)處理多個(gè)樣本，準(zhǔn)確性高，但是需要特殊的抗體，試驗(yàn)成本較高，尤其在處理少量樣品時(shí)，不適合用此方法。

間接評價(jià)法是指通過測定乳酸菌細(xì)胞表面的理化性質(zhì)來間接反映其粘附能力的強(qiáng)弱。比如疏水性、自聚集能力和表面電荷量等，其中最常用的表面性質(zhì)是疏水性。任大勇[12]檢測了9 株乳酸菌的自凝聚能力、疏水性和對Caco-2 細(xì)胞的粘附能力，通過相關(guān)性分析表明，乳酸菌的疏水性與菌株的粘附能力存在一定的正相關(guān)性。研究乳酸菌表面疏水性與其黏附性的相關(guān)性，一方面可以方便、快速地篩選高黏附性菌株，另一方面，有助于弄清乳酸菌與宿主粘附的作用機(jī)制。然而，也有研究不認(rèn)為兩者之間具有相關(guān)性[59]。疏水性只能作為篩選高黏附性乳酸菌的一個(gè)參考指標(biāo)。

近些年來，計(jì)算機(jī)在科研中得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。一些新的評價(jià)細(xì)菌粘附能力的方法出現(xiàn)。如計(jì)算機(jī)分子模擬法，即通過計(jì)算機(jī)軟件以原子水平的模型來模擬研究對象的結(jié)構(gòu)和行為，從而進(jìn)一步模擬物質(zhì)的各種理化性質(zhì)。Das 等[60]通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接軟件（Hex ver 6.0），分析4 種乳桿菌細(xì)胞表面的黏蛋白與腸黏蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)對接情況，篩選出對腸黏蛋白具有最高粘附能力菌株。

5 展望

目前，眾多研究報(bào)道了乳酸菌的粘附機(jī)理，主要集中在乳酸菌黏附素上，對腸道上皮細(xì)胞和黏液層受體的研究還應(yīng)深入探索。表層蛋白是目前研究較全面和深入的黏附素。近些年來對乳酸菌進(jìn)行全基因組測序和基因組學(xué)分析對深入了解乳酸菌粘附機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。在國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上可查多株乳酸菌表層蛋白的基因序列，可以通過基因組比對分析，得到全基因組測序菌株是否具有分泌SLP 的能力。對于具有益生功能但粘附能力很差的乳酸菌，將已知高黏附性乳酸菌的粘附相關(guān)蛋白基因序列重組到這些黏附性差的益生菌基因組中，使其在宿主體內(nèi)粘附定殖并更好地發(fā)揮益生功能，這是一個(gè)非常值得深入研究的新思路。