替莫唑胺對(duì)Livin基因過(guò)表達(dá)的膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞及其干細(xì)胞增殖活性的影響

李根華 馮嵩 韓光魁 馬文淵 劉臣 孔令勝 靳峰

膠質(zhì)瘤是成年人中最常見(jiàn)、最具有侵襲性的原發(fā)腦腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，雖然近年來(lái)治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不理想[1-2]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤，患者1年生存率低于30%，高級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤患者中期生存時(shí)間僅有約15個(gè)月[3]。腫瘤干細(xì)胞概念的提出給腫瘤生物學(xué)和治療方法帶來(lái)本質(zhì)的變化，相關(guān)文獻(xiàn)提示靶向腫瘤干細(xì)胞殺傷或者分化可能是對(duì)高侵襲性腫瘤最好的治療策略[4]。

在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中涉及到多種基因的失調(diào)。Livin是凋亡蛋白抑制基因（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員，既往研究發(fā)現(xiàn)Livin基因過(guò)表達(dá)與細(xì)胞增殖/凋亡、化學(xué)治療耐藥關(guān)系密切，而且Livin基因在不同細(xì)胞系表達(dá)量存在差異性[5]。IAP家族的抗凋亡機(jī)制主要是阻斷Caspase途徑激活而引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程，致使細(xì)胞凋亡停止，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)并延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間。為進(jìn)一步研究Livin基因與化學(xué)治療藥物干預(yù)后細(xì)胞增殖/凋亡的關(guān)系，課題組利用免疫磁珠分選方法從TJ905細(xì)胞系中分離培養(yǎng)出CD133+干細(xì)胞，使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)將細(xì)胞凋亡抑制基因Livin轉(zhuǎn)染進(jìn)膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞和TJ905干細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞中Livin基因表達(dá)量，建立相關(guān)細(xì)胞模型，給予不同濃度的替莫唑胺 （temozolomide，TMZ）干預(yù)，使用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）、流式細(xì)胞儀、CCK-8等技術(shù)檢測(cè)干預(yù)后細(xì)胞增殖活性及Livin、Caspase-3/7表達(dá)量的變化，探討TMZ對(duì)Livin基因介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞增殖活性的影響。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，美國(guó)），PI試劑盒（四季青公司，中國(guó)），表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growthfactor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、白血病抑制因子（leukemiainhibitory factor，LIF）（Peprotech公司，美國(guó)）、胰蛋白酶、B27（Gibco公司，美國(guó)），兔抗人CD133抗體、免疫磁珠（CD133+）細(xì)胞分選試劑盒（Miltenyi Biotec公司，德國(guó)），CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，日本），Livin基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體（上海吉?jiǎng)P基因有限公司）。

儀器：Multiskan酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)），生物安全柜Ⅱ.A2（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），熒光顯微OLYMPUS IX71 （奧林巴斯有限公司，日本），流式細(xì)胞儀BD LSRⅡ型（Becton Dickinson公司，美國(guó)），免疫磁珠分選儀（Miltenyi Biotec公司，德國(guó)），實(shí)時(shí)定量PCR儀Applied Biosystems（7900HT公司，美國(guó)）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及分選

膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞由天津神經(jīng)病學(xué)研究所建系并饋贈(zèng)。

細(xì)胞培養(yǎng)：條件均為37℃、5%CO2，TJ905細(xì)胞置于含10%胎牛血清的常規(guī)DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，TJ905干細(xì)胞置于含有EGF（20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

免疫磁珠分選CD133+細(xì)胞[6]：TJ905細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，利用免疫磁珠分離方法分選、培養(yǎng)CD133+干細(xì)胞，成球后用胰蛋白酶消化，5000個(gè)/孔接種96孔板，CCK-8檢測(cè)增殖活性，重復(fù)3次。

三、Livin基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建

按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值（TJ905細(xì)胞：MOI=5；TJ905干細(xì)胞：MOI=10）計(jì)算需要病毒數(shù)量，polybrene作用是增強(qiáng)慢病毒感染力，使用濃度為5 μg/mL，將計(jì)算好的慢病毒過(guò)表達(dá)載體病毒液體直接加入Enhanced Infection Solution（慢病毒稀釋液），混均后滴加到算好所需培養(yǎng)基中。在慢病毒過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染20 h后棄掉培養(yǎng)基，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)72 h后能在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，RT-PCR檢測(cè)Livin表達(dá)量的變化。細(xì)胞分組：TJ905細(xì)胞Livin過(guò)表達(dá)組 （TJ905 ACC-OE組：轉(zhuǎn)染慢病毒Livin過(guò)表達(dá)載體）、TJ905細(xì)胞Livin過(guò)表達(dá)對(duì)照組（TJ905 ACC-CON組：轉(zhuǎn)染慢病毒空載體）；TJ905干細(xì)胞Livin過(guò)表達(dá)組（TJ905 CSC-OE組：轉(zhuǎn)染慢病毒Livin過(guò)表達(dá)載體）、TJ905干細(xì)胞Livin過(guò)表達(dá)對(duì)照組（TJ905 CSC-CON組：轉(zhuǎn)染慢病毒空載體）。

四、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖及TMZ干預(yù)后細(xì)胞毒效應(yīng)

提前24 h在96孔板按105個(gè)/孔分別接種TJ905細(xì)胞及其干細(xì)胞，次日吸掉培養(yǎng)基后每孔添加TMZ濃度分別為0（空白對(duì)照）、25、50、100、200、400 μmol/L的TMZ培養(yǎng)基100 μL （空白對(duì)照以DMSO代替TMZ），每孔設(shè)2個(gè)副孔。TMZ干預(yù)48 h后棄掉培養(yǎng)基，每孔加100 μL CCK-8溶液（DMEM/F12∶CCK-8為9∶1），37℃溫箱孵育90 min，上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參照波長(zhǎng)630 nm，每組重復(fù)2次。

五、RT-PCR檢測(cè)Livin及Caspase-3/7基因表達(dá)量

分別用上述濃度的TMZ干預(yù)TJ905細(xì)胞及TJ905干細(xì)胞，并在干預(yù)48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增產(chǎn)物使用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行定量分析。PRIMER5.0設(shè)計(jì)Livin、Caspase-3/7引物序列，引物序列信息見(jiàn)表1，在反應(yīng)過(guò)程中每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)無(wú)cDNA做陰性對(duì)照。獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分析采用熒光定量PCR儀器自帶分析軟件分析標(biāo)本的Ct值，待測(cè)樣品相對(duì)值=2-△Ct，△Ct=Ct陰性對(duì)照-Ct待測(cè)樣品。

六、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，將所得細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后使用70%乙醇4℃固定過(guò)夜，次日PBS漂洗，添加500 μL配制好的PI染色液，37℃孵育30 min，4℃冰盒待檢。流式細(xì)胞儀采用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況，流式細(xì)胞儀自帶分析軟件分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料 （RT-PCR數(shù)據(jù)）以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)數(shù)據(jù)兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Livin基因轉(zhuǎn)染鑒定

慢病毒載體攜帶GFP蛋白，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)72 h后能在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光：普通倒置顯微鏡下觀察TJ905細(xì)胞呈正常膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)（圖1A），TJ905干細(xì)胞呈正常膠質(zhì)瘤干細(xì)胞形態(tài)（圖1B），熒光顯微鏡下均呈現(xiàn)相應(yīng)的綠色熒光（圖1C～D）。

二、CCK-8檢測(cè)Livin轉(zhuǎn)染前后及TMZ干預(yù)后細(xì)胞增殖活性

Livin基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖速度變快，而在化學(xué)治療藥物TMZ干預(yù)后細(xì)胞增殖速度減慢，CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TMZ能明顯降低4組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖速度，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖（表2）。

三、RT-PCR檢測(cè)Livin、Caspase-3/7基因表達(dá)量

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染前后膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞及其干細(xì)胞顯微鏡下觀察

表2 CCK-8檢測(cè)TMZ干預(yù)各組細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖活性

（1）TJ905細(xì)胞Livin基因表達(dá)量[（245.245±4.521）×10-5]高于TJ905干細(xì)胞[（23.566±1.231）×10-5]，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=81.953，P＜0.001）。慢病毒載體轉(zhuǎn)染后Livin基因過(guò)表達(dá)組表達(dá)量升高，Caspase-3表達(dá)量減低，Caspase-7表達(dá)量升高，與慢病毒空載體0 μmol/L對(duì)照差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）TMZ干預(yù)后隨著藥物干預(yù)濃度的增大Livin表達(dá)量降低，Caspase-3/7表達(dá)量增高，同組細(xì)胞藥物干預(yù)后與0 μmol/L對(duì)照，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明TMZ能有效抑制Livin基因表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3/7基因表達(dá)，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞及其干細(xì)胞凋亡。具體信息見(jiàn)表3～5。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化

TMZ干預(yù)細(xì)胞模型48 h后，TJ905 CSC-OE組誘導(dǎo)在S、G2/M停滯，CSC-CON組則是在S期停滯；TJ905 ACC-OE組在S期停滯，對(duì)G2/M則是低濃度誘導(dǎo)停滯，隨藥物濃度增加其誘導(dǎo)作用減弱，ACCCON在G2/M期停滯；TJ905 CSC-OE組與CSC-CON組、TJ905 ACC-OE組與ACC-CON組的上述周期檢測(cè)對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體信息見(jiàn)表6、圖2。

討論

目前，GBM患者的預(yù)后仍極差，即使接受手術(shù)切除聯(lián)合放射治療和化學(xué)治療的綜合治療方式，患者的5年生存率僅有10%[7]。目前膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案即手術(shù)切除，輔助以放射治療和化學(xué)治療，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。與其他烷化劑比較，TMZ是新型烷化劑、小分子物質(zhì)，能有效穿過(guò)血腦屏障，具有獨(dú)一無(wú)二的特性。多種研究已經(jīng)證實(shí)TMZ是高級(jí)別膠質(zhì)瘤的有效藥物，能有效延長(zhǎng)GBM患者的生存時(shí)間，使GBM患者單獨(dú)放射治療的2年生存率10.4%提高到聯(lián)合治療的26.5%[8-9]。但無(wú)論何種治療方式均不能有效改善患者預(yù)后，提高患者生存質(zhì)量。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者經(jīng)TMZ治療后很快出現(xiàn)化學(xué)治療耐藥，治療效果變差?；谀z質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀，本研究采用GBM細(xì)胞系TJ905及其干細(xì)胞，探討目前臨床一線化學(xué)治療藥物TMZ對(duì)TJ905細(xì)胞及其干細(xì)胞的細(xì)胞增殖/凋亡的影響，為膠質(zhì)瘤化學(xué)治療耐藥研究提供一定的實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。

表3 RT-PCR檢測(cè)TMZ干預(yù)各組細(xì)胞48 h Livin mRNA表達(dá)變化（×10-5）

表4 RT-PCR檢測(cè)TMZ干預(yù)各組細(xì)胞48 h Caspase-3 mRNA表達(dá)變化（×10-5）

表5 RT-PCR檢測(cè)TMZ干預(yù)各組細(xì)胞48 h Caspase-7 mRNA表達(dá)變化（×10-5）

表6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TMZ干預(yù)48 h細(xì)胞周期變化（%）

Livin是IAP家族成員，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和控制細(xì)胞周期方面起著關(guān)鍵作用[10]。細(xì)胞凋亡是Caspase激活的協(xié)調(diào)效應(yīng)，Caspase-3/7在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著細(xì)胞凋亡啟動(dòng)、細(xì)胞凋亡執(zhí)行的重要作用，尤其在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑，細(xì)胞色素C從線粒體解除，并與Apaf-1結(jié)合，導(dǎo)致Caspase-9重組和凋亡小體形成，Caspase-9激活介導(dǎo)的凋亡小體激活Caspase-3和Caspase-7，其促進(jìn)細(xì)胞死亡，但是激活的Caspase能被內(nèi)源性抑制劑IAP抑制[11-13]。

腫瘤干細(xì)胞存在類似于正常干細(xì)胞的細(xì)胞休眠靜止?fàn)顟B(tài)的特性，對(duì)放射治療和化學(xué)治療敏感性差，導(dǎo)致其能在放射治療和化學(xué)治療后仍能存活一部分，而正是僅存的這部分腫瘤干細(xì)胞成為膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的源頭[14]。為了解Livin基因?qū)瘜W(xué)治療藥物干預(yù)前后細(xì)胞增殖/凋亡的影響，本研究構(gòu)建了Livin基因慢病毒過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，并使用不同藥物濃度的TMZ干預(yù)，檢測(cè)藥物干預(yù)后細(xì)胞模型中Livin基因的變化，了解細(xì)胞增殖/凋亡的變化，有助于進(jìn)一步研究Livin基因與細(xì)胞增殖/凋亡、化學(xué)治療耐藥的關(guān)系。

圖2 TMZ干預(yù)各組細(xì)胞48 h細(xì)胞周期變化

本研究發(fā)現(xiàn)，Livin基因在膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞表達(dá)量顯著高于TJ905干細(xì)胞，與之前研究膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞時(shí)結(jié)果相反，說(shuō)明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在分化、增殖過(guò)程中可能存在不穩(wěn)定性[15]。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Livin基因表達(dá)量的多少可能與細(xì)胞增殖速度有關(guān)，說(shuō)明細(xì)胞凋亡抑制基因Livin在細(xì)胞增殖過(guò)程中起著重要作用，但由于大多數(shù)干細(xì)胞為休眠狀態(tài)，只有在激活條件下才能分裂、增殖，因此要檢測(cè)Livin基因表達(dá)量的多少與細(xì)胞增殖之間的關(guān)系，需在同種細(xì)胞內(nèi)完成，單純檢測(cè)Livin基因表達(dá)量的高低并不能比較普通腫瘤細(xì)胞與其干細(xì)胞增殖活性強(qiáng)弱。藥物干預(yù)后，膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞和TJ905干細(xì)胞中Livin基因表達(dá)量隨著藥物濃度增加而降低，Caspase-3/7基因表達(dá)增高，再次說(shuō)明Livin基因與Caspase之間存在密切關(guān)系，在膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有重要作用。

運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將Livin基因轉(zhuǎn)染進(jìn)膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞和TJ905干細(xì)胞后，細(xì)胞周期發(fā)生變化，Livin基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞周期G0/G1增加明顯，而TJ905細(xì)胞周期則是G2/M期少量增加，研究結(jié)果說(shuō)明Livin基因在膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞和TJ905干細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞周期的影響機(jī)制存在差異，也可能是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞存在休眠狀態(tài)，轉(zhuǎn)染后激活干細(xì)胞細(xì)胞分裂所致。而在TMZ干預(yù)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其干細(xì)胞細(xì)胞周期停滯在不同的分裂周期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減緩。TMZ能明顯抑制膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞和TJ905干細(xì)胞的增殖活性，且相同干預(yù)條件下，對(duì)TJ905細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于TJ905干細(xì)胞，干細(xì)胞比普通細(xì)胞的表現(xiàn)出有更強(qiáng)的化學(xué)治療藥物耐藥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TMZ能有效抑制TJ905細(xì)胞及其干細(xì)胞的增殖，由于腫瘤干細(xì)胞在分化過(guò)程中存在不穩(wěn)定性，Livin、Caspase基因雖然在細(xì)胞抗凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，且TMZ可有效地抑制膠質(zhì)瘤TJ905細(xì)胞及TJ905干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但考慮細(xì)胞凋亡有著不同的細(xì)胞凋亡途徑，單純給予TMZ治療并不能有效徹底地抑制腫瘤增殖。因此，膠質(zhì)瘤的治療需要多種治療方式聯(lián)合應(yīng)用。單純針對(duì)干細(xì)胞中Livin、Caspase-3/7基因靶向治療并不能有效解決膠質(zhì)瘤化學(xué)治療耐藥及復(fù)發(fā)。鑒于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的局限性，后期將根據(jù)本研究結(jié)果進(jìn)一步完善相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。